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技术与服务

CRISPR/Cas9基因编辑

技术简介

CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了获得性免疫:这与哺乳动物的二次免疫类似,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi) 的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能,      CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中,CRISPR/Cas系统拥有多种类别,其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入,应用最成熟的一种类别。

CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉,操作方便,效率高等优点,CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室,成为了生物科研的有力帮手。

技术原理

CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeat)与长度相似的间隔序列(spacer)间隔排列组成。Cas基因是一类基因家族,编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性。根据Cas 基因的不同,将CRISPR-Cas9系统分为Ⅰ-Ⅲ 3种类型。在Ⅰ型 与Ⅲ型CRISPR-Cas9系统中,pre-crRNA 初级转录本被CRISPR相关RNA 酶切割成重复序列,释放小的成熟crRNA。成熟crRNA再与相关蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合体指导内切核酸酶对外源DNA 序列的识别与降解。Ⅱ型CRISPR-Cas9系统是目前最常用于人工基因组编辑的CRISPR-Cas9系统。根据Cas蛋白的类型不同分为3个亚类:Ⅱ-A型含有Cas1、Cas2、Cas9 和Csn2蛋白质;Ⅱ-B型含有Cas1、Cas2、Cas4 和Csx12 样Cas9 4种蛋白质;Ⅱ-C型则有Cas1、Cas2 及Cas93种蛋白质。其中,Ⅱ 型CRISPR-Cas9 系统最早在改造后用于小鼠和灵长类基因组编辑,是目前研究最为充分的系统。它只需要单独的Cas9蛋白即可在gRNA(guide RNA)的引导下完成对DNA的定点切割。Cas9 蛋白行使功能需CRISPR转录而来的crRNA 与反式激活的及与CRISPR重复区互补的tracrRNA(trans-activiting crRNA,tracrRNA)形成的复合物参与。

为了操作简便,研究者将crRNA和tracrRNA 融合进同一条单链中,设计出单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)。在sgRNA的指导下,Cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。对靶序列有效的切割还需靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序,即PAM(protospacer-associated motif)的参与。PAM提供两个冗余的检查点,确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理为将tracrRNA:crRNA设计为sgRNA,sgRNA包含位于5′端的靶DNA的互补序列,以及位于3′端的tracrRNA:crRNA的类似序列,crRNA 或sgRNA包含一个20nt指导序列可以直接匹配的靶位点,利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点,利用tracrRNA:crRNA的类似序列与Cas9结合,实现目标基因定向基因组改造。


图1. CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理

应用

技术优势

1. 效率高:可精确编辑基因组,编辑效率高;

2. 周期短:构建和使用极为方便,极大降低了实验难度,缩短实验周期;

3. 广谱性:无基因、细胞及物种限制;

4. 多重编辑能力:可实现多个靶位点同时进行基因打靶;

5. 功能丰富:可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因.

服务步骤

服务项目周期

编号

项目内容

周期(周)

注:周期为工作日

1

sgRNA的设计与构建

(设计8条sgRNA序列)

1

2

sgRNA的筛选

2

3

载体构建

注:sgRNA串联几个待定,需要等筛选结果


3

4

转染目标细胞系,qPCR方法检测载体活性

1

5

病毒包装

3

交付内容:一个病毒和两个筛选报告

合计:10

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