溶瘤病毒改造-服务武汉枢密脑科学技术有限公司

服务

溶瘤病毒改造

简介

溶瘤病毒（oncolytic viruses, OVs）是指一类天然的或经基因工程改造的，可选择性地在肿瘤组织内复制，进而感染杀伤肿瘤细胞或导致肿瘤细胞裂解，但对正常组织无杀伤作用的病毒。

单纯疱疹病毒，水泡性口炎病毒、牛痘病毒及呼肠孤病毒都是目前主要的常用溶瘤病毒。溶瘤病毒具备良好的安全性，可长效表达抗肿瘤的外源基因；能直接裂解肿瘤，对肿瘤细胞杀伤效率高、靶向性好、副作用小和成本低廉等独特的优势。

机制包括两个方面：

(1) 直接作用：病毒自身对肿瘤细胞的毒性作用，包括病毒颗粒、毒蛋白的毒性作用等；

(2) 间接作用：病毒作用于肿瘤细胞及微环境，激活免疫系统对肿瘤细胞的攻击，许多免疫调节分子、免疫共刺激分子，或通过和病毒联用实现效果，或通过基因工程改造在病毒中实现效果。

分类

根据遗传物质的不同，可以将已进入临床阶段的溶瘤病毒分为：DNA类溶瘤病毒和RNA类溶瘤病毒

DNA类溶瘤病毒特点：

● 可以编辑DNA病毒的大基因组而不影响病毒的复制

● 可编码大型真核转基因以增强治疗活性或免疫调节

● 表达高保真度DNA聚合酶，确保病毒基因组的完整性和高效复制

● 基因组的核整合即使有，也是有限的

表1 DNA类溶瘤病毒载体

RNA类溶瘤病毒特点：

● 体积小，可以穿过血脑屏障，从而能够靶向中枢神经系统的肿瘤；

● 病毒生活周期完全在胞质中进行，无细胞DNA整合风险

表2 RNA类溶瘤病毒载体

应用

1、缺失病毒的某些基因，这些基因的产物是病毒在正常细胞中复制所必需的，但在肿瘤细胞中复制却是非依赖或非必需的，所以这种缺陷病毒在正常细胞中不能有效复制。

1) JX-594（也称为Pexa-Vec）是由托马斯杰斐逊大学的Edmund Lattime 博士实验室构建的溶瘤痘病毒，由于缺失胸苷激酶基因(TK)，插入GM-CSF基因，引发机体抗肿瘤免疫反应。

图1 JX-594抗肿瘤作用原理

2)2015年，安进公司的溶瘤单纯疱疹病毒T-VEC在HSV-1病毒JS1毒株的基础上删除了ICP34.5和ICP47基因，同时插入GM-CSF基因，用于治疗黑色素瘤，成为第一个获得美国食品和药物管理局（FDA）批准的Ovs类治疗药物。

3) 溶瘤病毒HSV-1促进瘤内T细胞浸润并改善抗pd-1免疫治疗。

图2 溶瘤病毒HSV-1增强PD-1单抗免疫治疗效果模式图

2、利用肿瘤(靶)细胞中抑癌基因的失活或相关信号通路的缺陷，选择性的在靶细胞内复制，最终导致肿瘤细胞溶解和死亡，而在正常细胞内只是少量存在或不能增殖。

3、利用缺失多个病毒相关基因提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。

GL-ONC1是一种改良的牛痘苗病毒，其有效性可通过放疗和化疗得到增强。确定GL-ONC1经放化疗静脉注射给原发性、非转移性头颈癌患者的安全性。

溶瘤病毒改造服务

枢密科技开发了常用溶瘤病毒毒株的重组、突变、拯救、扩增技术。通过此技术，我们可以根据客户的需求，设计最优路径，灵活高效地实现溶瘤病毒毒株的突变和重组毒株的构建。

1、痘病毒（VACV，Vaccinia virus）

牛痘病毒（VV）是体积最大结构最复杂的DNA病毒，具有线性双链DNA基因组，长度约为190kb，可编码约200个基因VV也是唯一在胞浆内复制的DNA病毒，能感染几乎所有哺乳和禽类细胞。目前比较常见的VV主要有Western Reverse株、Lister株、Wyeth株、Ankara株、New York Vaccinia株、Copenhagen株和天坛株，其中Western Reverse株、Lister株、Wyeth株和Copenhagen株具有溶瘤特性，且Western Reverse株溶瘤特性最强。

VV作为dsDNA病毒，具有独特的生物学特点：

(1)快速复制；(2)病毒基因不会整合到细胞中；(3)几乎可感染进入所有细胞系；(4) 可远距离输送到转移瘤中，可容纳较大外源基因(~25kb)，储存运输方便；(5) VV的生长因子（VGF）基因与表皮生长因子（EGF）同源，可与细胞表面的EGF受体（EGFR）结合，激活Ras通路，进一步启动细胞周期并促进细胞分化，而细胞分化又会促进TK的合成，提高病毒的感染效率。这对于病毒在正常的细胞中扩增十分重要，而在本身可以大量增值的肿瘤细胞是非必需的。

溶瘤痘苗病毒对肿瘤具有天然的趋向性。静脉注射溶瘤痘苗病毒到患肿瘤的动物后，在肿瘤部位能检测到高表达的病毒。尽管痘苗病毒有着显着的肿瘤趋向性，但是为了进一步提升其靶向性，增加病毒特异性，目前主流的改造方式有两种：

● 缺失痘苗病毒生长因子(vaccinia growth factor, VGF)

● 缺失胸腺激酶( Thymidine kinase, TK)

重组VV和其他痘病毒最近取得了四项重大进展，以提高其作为癌症疫苗或OV的效用：

● 进一步修饰病毒载体，使其更具免疫原性，从而更有效地引发抗肿瘤免疫；

● 用编码特定肿瘤相关抗原（TAA）或新抗原的基因武装病毒，以改善对特异性T细胞介导的免疫的诱导；

● 用免疫刺激分子武装病毒，以进一步增强其免疫原性。

枢密科技使用Western Reverse（WR）株，对其J2R（TK）、A56R（血凝素）、F14.5等特定基因进行敲除，能够使其具有肿瘤选择性，同时插入外源基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-6（IL-6）等可以增强免疫反应。

公司现有多种现货病毒产品己针对多个基因进行缺失或插入，如有需要欢迎致电详询!

2、单纯疱疹病毒（HSV, herpes simplex virus）

对HSV病毒ICP34.5（RL1）、ICP47、US11、TK等特定基因进行敲除，能够使其具有肿瘤选择性，同时插入外源基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、P53、PD1等可以增强免疫反应。

服务流程：

客户提供：(1)病毒毒株或种类；(2)病毒基因组改造位点及改造类型；(3) 病毒滴度和总量需求

服务周期：

（1）现货产品

现货产品	产品编号	产品内容	服务周期（工作日）
HSV-1 （129株）	H03002	HSVΔTK-LSL-tdTomato	5-10
	H04001	HSV-LT-hUbC-tdTomato-WPRE
	H04002	HSVΔ34.5-EGFP-ΔTK
	H04003	HSVΔ34.5-ΔTK-DID-tdTomato
VACV (WR株)	VV01001	VV-ΔTK+T7-RNA聚合酶	5-10
	VV01002	VV-ΔTK+EGFP
	VV01003	VV-ΔTK+mCherry
	VV02001	VV-ΔA56R+EGFP
	VV03001	VV-ΔA56R-ΔTK

（2）定制产品

HSV-1/VACV（HSV-1，可提供129株和KOS株； VACV，提供WR株）			VSV（印第安纳株）
服务内容		周期（工作日）	服务内容	周期（工作日）
分子克隆	1、常规重组载体	10	分子克隆（基因合成额外收费）	20
	2、插入指定基因	15（合成周期另算）
重组、挑斑、纯化（一步重组）		35	病毒拯救	30
初鉴定		5	初鉴定	5
重组病毒扩增、浓缩		5	重组病毒扩增、浓缩	10
产品质检报告（分子鉴定）		5	产品质检报告（分子鉴定）	5

交付内容：病毒、荧光图、滴度测定报告、凝胶电泳PCR扩增鉴定报告。如有特殊需求，如病毒全基因组测序报告，价格和周期相应调整。