AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰-服务武汉枢密脑科学技术有限公司

服务

AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰

原理介绍

circRNAs（CircularRNAs，环形RNA分子）是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子，通过非经典剪接方式进行反向剪接而形成。circRNA由特殊可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，主要来源于外显子，少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中，表达水平具有种属、组织、时间特异性。circRNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更加稳定，具有一定序列保守性，在转录或转录后水平发挥调控作用。绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数可以翻译为多肽。

circRNA的作用机制有：1、作为miRNA分子的海绵（主要的），circRNA含有大量的miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。2、作为蛋白分子的海绵，有些环状RNA上有一个或者多个RNA结合蛋白的结合位点，可作为蛋白分子的海绵体。3、引起免疫响应，有些内源性环状RNA在抗病毒反应中发挥作用，而有些环状RNA与免疫响应相关，外源性环状RNA可以通过激活模式识别受体RIG-I刺激哺乳动物细胞的免疫信号。4、编码功能，circRNA虽然属于非编码RNA，但是也有少数circRNA可以编码多肽，通过编码多肽行使调控功能。

图1.circRNA的生物发生（Kristensen LS,et al.Nat Rev Genet.2019.）

AAV介导circRNA过表达应用实例（Meganck RM, et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2021.）

C57BL/6小鼠尾静脉注射（3×1011vg/每只）AAV9-CMV-HIPK3 Polio（HIPK3内含子+脊髓灰质炎病毒IRES+GFP外显子）及AAV9-CMV-HIPK3 Polio△△（L△R△内含子+脊髓灰质炎病毒IRES+GFP外显子），4周后取材切片观察，结果显示均可在心脏、肝脏及肌肉中过表达，且L△R△内含子对的circRNA表达效果更好。

图2. L△R△内含子对可增加小鼠体内多个组织中的circRNA表达

我司提供AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰服务

服务说明

我司提供pAAV-ciR、pLV-ciR等circRNA过表达载体构建服务，同时可选择携带各种荧光报告基因或抗性基因，适用于普通真核表达、慢病毒包装与稳转细胞系建立、腺相关病毒包装等多种用途。该系列载体均含有circRNA环化表达框架，用于克隆目标circRNA的线性序列，之后转染细胞后可通过RNA剪切形成circRNA分子。

我司针对circRNA的接头序列设计多条siRNA序列，筛选特异性高效干扰目的circRNA表达的siRNA，构建shRNA病毒载体并包装所需病毒。也可直接转染或通过包装慢病毒感染细胞筛选circRNA特异性敲低稳定细胞株。

过表达服务流程

1、客户提交circRNA资料（ID号或者序列）、构建要求；

2、circRNA过表达载体构建；

3、载体验证（根据客户选择，默认提供293细胞转染验证环化效果）；

4、病毒包装；

5、稳定细胞株构建（根据客户需要选择，需要客户提供目标细胞）。

需客户提供内容/材料

1：过表达的目的基因模板（质粒/菌液）或基因序列（基因ID）；

2：病毒类型选择以及要求；

3：血清型选择。

最终交付

1：载体构建报告；

2：合同约定的rAAV/慢病毒的滴度和病毒量；

3：质检报告；

4：测序文件；

5：过表达质粒/病毒/稳定细胞系。

RNA干扰服务流程

1、客户提交circRNA资料（ID号或者序列）、构建要求；

2、设计多条siRNA，筛选高效率干扰siRNA；

3、设计circRNA特异性引物，检测敲低circRNA的效率；

4、构建shRNA载体，干扰慢病毒或腺相关病毒包装；

5、稳定细胞株构建（可选，需要客户提供目标细胞）。

注：过表达筛选保证3条里面有1条干扰效率达到70%以上。

表1.服务内容及周期

实验名称	服务内容	周期（工作日）	备注
circRNA siRNA筛选	siRNA设计和合成	15	1条阴性对照、3条siRNA
	细胞转染（客户提供细胞）
	PCR干扰效率验证
circRNA shRNA载体构建	载体构建	15-20	1.一条shRNA质粒；2.对照shRNA质粒；3.干扰验证报告
	细胞转染（客户提供细胞）
	PCR干扰效率验证
病毒包装	干扰慢病毒或腺相关病毒	10-15	干扰病毒液、对照病毒液
稳定细胞株构建检测（可选）	circRNA稳定细胞株筛选（客户提供细胞）	20-25	病毒感染后筛选，检测干扰效率