CRISPR/Cas9系统中sgRNA识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂,通过细胞内的同源重组(Homologous Recombination,HR)修复方式,将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中,从而实现基因敲入。
图1.CRISPR/Cas9基因敲入示意图(Eric Murillo-Rodríguez,et al.,Sleep and Vigilance,2018)
利用CRISPR/Cas9基因敲入构建KI小鼠
图2.利用CRISPR/Cas9同源重组构建基因敲入小鼠。
向受精卵注射Cas核酸酶、sgRNA以及含有敲入片段的供体,筛选经过同源重组敲入成功的胚胎干细胞,植入代孕鼠体内发育成完整个体(Yang H,et al.Cell.2013)。
图3.通过同源重组在Nanog基因第4个外显子末端插入报告基因荧光蛋白Cherry(A)。
Southern显示重组成功。Nanog基因只在胚胎干细胞表达,干细胞分化后nanog基因不再表达,表现为干细胞表达荧光蛋白Cherry,分化后的细胞无荧光(Yang H,et al.Cell.2013)。
服务内容
1、sgRNA的设计;
2、细胞内sgRNA剪切活性筛选;
3、敲入载体的构建:Cas9-sgRNA表达质粒、donor质粒;
4、依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式:
a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统(Cas9、sgRNA和donor);
b、脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染(Cas9、sgRNA和donor);
5、筛选基因敲入单克隆细胞系。
服务流程
需客户提供内容/材料
1.目的基因序列(ID)以及物种来源;
2.靶细胞系及细胞培养条件(可选);
3.病毒类型选择以及要求;
4.血清型选择。
表1.服务信息及最终交付内容、产品
流程分布 |
周期
(工作日)
|
交付内容 | 交付产品 |
sgRNA序列的设计 | 2-4周 | sgRNA设计分析报告 | - |
sgRNA的活性筛选 | 获得有活性的sgRNA及筛选报告 | ||
基因敲入质粒的构建 | 2周 | 基因敲入质粒报告 | 基因敲入质粒 |
病毒包装 | 3周 | 病毒包装报告 | 高纯度病毒 |
单克隆细胞分选 | 6-8周 | 单克隆细胞分选及检测结果报告 | 基因敲入单克隆细胞系 |
信息订阅
我们将及时向您推送最新产品资讯
市场:027-65023363 行政/人事:027-62439686 邮箱:marketing@brainvta.com
销售总监:张经理 18995532642 华东区:陈经理 18013970337 华南区:王经理 13100653525 华中/西区:杨经理 18186518905 华北区:张经理 18893721749
地址:中国武汉东湖高新区光谷七路128号中科开物产业园1号楼
Copyright © 武汉枢密脑科学技术有限公司. All RIGHTS RESERVED.
鄂ICP备2021009124号 DIGITAL BY VTHINK