CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas)系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统,此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来,能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中,进行有效的靶向编辑,具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(short guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂(double-strand break, DSB),机体自身通过非同源重组(non-homologous end joining,NHEJ)的方式修复DSB,参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基,修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失,从而实现机体内的基因敲除。
CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑(Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015)
1. CRISPR/Cas9基因敲除细胞系建立
2. CRISPR/Cas9基因敲除建立动物疾病模型
1. 操作简易:仅需Cas9核酸酶和sgRNA即可对目标基因靶位点进行切割;
2. 效率高:在基因组水平上编辑目标基因,高度模拟目标模型,可精确编辑基因组;
3. 作用靶位点多:可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除;
4. 提供多种基因编辑病毒工具:AAV、LV;
5. 提供BSL-1和BSL-2病毒注射及实验操作平台;
6. 全面的实验技术支持。
1. sgRNA的设计;
2. 细胞内sgRNA剪切活性筛选;
3. 敲除载体的构建;
4. 依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式:
a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统(Cas9和sgRNA);
b、 脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染(Cas9和sgRNA);
5. 筛选基因敲除单克隆细胞系。
1. 目的基因基因序列(序列/ID)以及物种来源;
2. 需介导基因敲除的细胞(可选);
3. 病毒类型选择以及要求;
4. 血清型选择。
流程分布 |
周期
(工作日)
|
交付内容 | 交付产品 |
sgRNA序列的设计 | 2-4周 | sgRNA设计分析报告 | - |
sgRNA的活性筛选 | 获得有活性的sgRNA及筛选报告 | ||
基因敲除质粒的构建 | 1周 | 基因敲除质粒报告 | 基因敲除质粒 |
病毒包装 | 3周 | 病毒包装报告 | 高纯度病毒 |
单克隆细胞分选 | 8周 | 单克隆细胞分选及检测结果报告 | 基因敲除单克隆细胞系 |
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Haoyi Wang等人研究发现,CRISPR / Cas介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干(ES)细胞中的五个基因(Tet1,2,3,Sry,Uty-8等位基因),通过NHEJ引入多个随机indel的靶向突变。将靶向Tet1和Tet2的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中,在两种基因中产生具有双等位基因突变的小鼠,效率为80%。CRISPR / Cas系统允许一步产生携带多个基因突变的动物,这种方法将大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。
小鼠胚胎干细胞的多基因敲除(Wang H et al. Cell, 2013)
小鼠和小鼠胚胎干细胞的多基因编辑(Wang H et al. Cell, 2013)
1. Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).
2. Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.
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