CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas)系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统,此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来,能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中,进行有效的靶向编辑,具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(short guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂,通过细胞内的同源重组修复方式,将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中,从而实现基因敲入。
CRISPR/Cas9基因敲入示意图(Eric Murillo-Rodríguez et al., Sleep and Vigilance, 2018)
1.CRISPR/Cas9基因片段敲入细胞系建立
2.CRISPR/Cas9基因单碱基突变细胞系建立
3.CRISPR/Cas9基因敲入建立动物疾病模型
1.操作简易:仅需Cas9核酸酶、sgRNA和供体DNA片段(donor),即可定点敲入外源基因片段;
2.效率高:在基因组水平上编辑目标基因,高度模拟目标模型,可精确编辑基因组;
3.广谱性:无物种限制、无细胞种类限制;
4.提供多种基因编辑病毒工具:AAV、LV;
5.提供BSL-1和BSL-2病毒注射及实验操作平台;
6.全面的实验技术支持。
1.sgRNA的设计;
2.细胞内sgRNA剪切活性筛选;
3.敲入载体的构建:Cas9-sgRNA表达质粒、donor质粒;
4.依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式:
a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统( Cas9、sgRNA和donor ) ;
b、脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染( Cas9、sgRNA和donor ) ;
5.筛选基因敲入单克隆细胞系。
1. 目的基因序列(序列/ID)以及物种来源;
2. 靶细胞系及细胞培养条件(可选);
3. 病毒类型选择以及要求;
4. 血清型选择。
流程分布 |
周期
(工作日)
|
交付内容 | 交付产品 |
sgRNA序列的设计 | 2-4周 | sgRNA设计分析报告 | - |
sgRNA的活性筛选 | 获得有活性的sgRNA及筛选报告 | ||
基因敲入质粒的构建 | 2周 | 基因敲入质粒报告 | 基因敲入质粒 |
病毒包装 | 3周 | 病毒包装报告 | 高纯度病毒 |
单克隆细胞分选 | 6-8周 | 单克隆细胞分选及检测结果报告 | 基因敲入单克隆细胞系 |
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Yang H等人研究发现,通过同源重组在Nanog基因第4个外显子末端插入报告基因荧光蛋白cherry(A)。Southern显示重组成功(B)。Nanog基因只在胚胎干细胞表达,干细胞分化后Nanog基因不再表达,表现为干细胞表达荧光蛋白cherry,分化后的细胞无荧光(C)。
(Yang H et al. Cell, 2013)
[1] Eric Murillo-Rodríguez, Rocha N B , André Barciela Veras, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J]. Sleep and Vigilance, 2018, 2(1):1 3-21.
[2] Yang H, Wang H, Shivalila CS, et al. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 2013;154(6):1370-9.
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