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技术与服务

AAV/LV介导基因过表达

原理

基因过表达是将目的基因的编码区克隆到相应的工具病毒载体上,导入细胞使基因实现大量转录和翻译,从而实现目的基因的过表达。此外,还可选择报告基因进行目的基因表达的追踪。

AAV简介

腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)属于细小病毒科(parvoviridae),病毒颗粒无包膜,结构为直径约20 nm的正二十面体,是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造,可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体,极大增加了AAV的应用潜力。研究中采用的重组腺相关病毒(Recombination adeno-associated virus,rAAV)载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体,具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点,已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。


表1靶向不同的器官及组织推荐使用对应AAV血清型、启动子及注射方式

类别 感染部位 注射方式 启动子 血清型
CNS(部分脑区,经验值) VHPC 脑立体定位注射 广谱启动子 2、5、8、9
NAC 脑立体定位注射 广谱启动子 2、5、8、9
DG 脑立体定位注射 广谱启动子 2、5、8、9
VTA 脑立体定位注射 广谱启动子 2、5、8、9
全脑 侧脑室小脑延髓池 广谱启动子 9、phpeb
尾静脉,颈静脉/颈动脉 广谱启动子 phpeb
眼球后静脉 广谱启动子 9、phpeb
脊髓 鞘内注射 CMV 9
PNS 眼睛 玻璃体腔注射/视网膜下腔注射/晶状体 CAG,视网膜特异性启动子rpe65 2、anc80L65(视网膜),shH10(视网膜穆勒细胞)
鼻吸/气管注射 CMV、CAG 6.2、6
胰腺 腹腔注射 CAG 8、pan
肾脏 尾静脉/肾动脉、肾静脉和左髂脉、腹主动脉 CMV 2、9
肾盂原位注射
肠道 肠系膜上动脉注射灌肠 CAG 8、9和10
骨髓 骨髓腔 9
心脏 尾静脉/颈静脉注射 cTNT 9
心内腔注射心肌内定点注射 CMV、cTNT 9
脾脏 静脉注射 6
卵巢 腹腔注射 CMV、CAG 2
睾丸 上后肢注射/睾丸注射 CMV、CAG 2
骨骼肌 静脉注射 8、9
胫骨前(tibialis anterior ) CMV 8、9
肌肉注射(后肢的股四头肌,腓肠肌和胫骨颅骨肌) 1、6
骨骼肌 静脉注射 CAG,骨骼特异性启动子Col2.3,Sp7 8
肝脏 尾静脉注射 TTR,TBG,EF1a 8
肝内注射
腹腔注射
脂肪 尾静脉 脂肪特异性启动子FABP4(aP2) 8、9
内脏脂肪-腹腔内注射 CMV 8、9
皮下脂肪-皮下注射 CMV 8、9
耳朵/圆窗膜round window membrane (RWM) CMV、CAG anc80L65、ie、8
血管 腹主动脉局部感染 CMV 1、5
滑膜关节 关节 5
平滑肌 尾静脉/气管 SM22a 1、2


rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因,仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。AAV的总包装容量是4.7 kb,目的基因长度要求不超过3.5 kb。

慢病毒简介

慢病毒是逆转录病毒科的一个属,属于单链RNA病毒,是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)的基础上发展起来的病毒载体,能够有效感染分裂细胞和非分裂细胞,整合到宿主基因组上实现长期稳定表达。慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右(还取决于载体本身是否有其他抗性基因或报告基因)。一般而言插入的片段如果在5kb以下产生的病毒滴度比较高,当插入的片段大于6kb的时候得到的病毒滴度往往不高。如果除去一般携带的抗性基因和报告基因,则往往只余下3kb左右的容量供目的片段的插入。我司通过载体改造去除一些不必要基因,在一些特殊情况下,可以最大插入7kb的基因片段。

应用


图1. 5种血清型AAV载体不同注射量基因表达效果

颈静脉注射cTnT启动表达eGFP的5种血清型AAV载体,4周后心脏冰冻切片荧光检测显示AAV9 1×1011vg病毒量时eGFP在心肌细胞表达最强。

参考文献:

Prasad KM, Xu Y, Yang Z, et al. Gene Ther. 2011.


图2. miR-30d表达水平


在MI(心肌梗死)手术前1周的开胸手术中单点心肌注射25μL过表达miR-30d慢病毒,结果显示术后三周心脏中miR-30d水平增加2倍。

参考文献:

Li J, Salvador AM, Li G, et al. Circ Res. 2021.


基因表达调控-基因稳定过表达及敲低

CRISPR/Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时,Cas9将不具有核酸酶活性,成为dCas9(dead Cas9)。CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子(如VP64、VPR、SAM或SunTag)或转录抑制因子(如KRAB)融合后,结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。


图1 CRISPR-dCas9系统调控内源基因(Gilbert et al., Cell, 2013)


应用

CRISPR-dCas9转录激活:可实现目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC、激活沉默基因、遗传缺陷补偿等;

CRISPR-dCas9转录抑制:可实现抑制目的基因表达、分析代谢途径、敲低特定基因转录量以研究基因功能、可与CRISPR/Cas9 Gene Knockout或RNAi技术联合作用等。

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