神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是指存在于神经系统中,能进行自我更新,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜能的细胞群,能产生大量脑组织细胞。研究表明,成年哺乳动物脑中存在NSCs,主要分布于海马齿状回颗粒细胞下层(subgranular zone, SGZ)和侧脑室室管膜下区(subventricular zone, SVZ)。
神经干细胞治疗的机理是:(i)患病部位组织损伤后释放各种趋化因子,可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位,并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞,修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤,使局部通透性增加,另外在多种黏附分子的作用下,神经干细胞可以透过血脑屏障,高浓度的聚集在损伤部位;(ii)神经干细胞可以分泌多种神经营养因子,促进损伤细胞的修复;(iii)神经干细胞可以增强神经突触之间的联系,建立新的神经环路。
基因修饰神经干细胞系,是通过基因工程技术,对神经干细胞进行遗传修饰,使其稳定表达特定的外源基因,如荧光蛋白、神经递质探针、钙离子探针、光敏感蛋白等,实现对细胞进行实时观察与精确操纵,应用于电生理、光遗传学、神经回路示踪等多种领域。
图1.神经干细胞的特性。神经干细胞能够分泌神经营养因子、生长因子和细胞因子来保护神经系统;神经干细胞分化为神经元或胶质细胞前体细胞,再分化为神经元和胶质细胞来替代神经系统中丢失的细胞,在神经损伤修复中起到重要作用。(图片修改自Tang Y, et al. Cell Death Dis. 2017)
图2.基因修饰神经干细胞产品应用举例。
装载钙离子探针GCaMP6f的神经祖细胞
文献标题:Characterization of calcium signals in human induced pluripotent stem cell-derived dentate gyrus neuronal progenitors and mature-neurons;stably expressing an advanced calcium indicator protein
研究人员将人源诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)诱导分化为海马神经祖细胞(Neural Progenitor Cells, NPCs)。研究表明,在NPCs的长期培养过程中,钙信号是高度可变的,配体诱导的钙瞬变可能预测其产生成熟神经元的能力。为在不需要染料加载的情况下研究钙信号传导,利用睡美人转座子质粒(据报道能在人胚胎干细胞中提供稳定的转基因表达;包含嘌呤霉素抗性基因)结合转座酶,并通过嘌呤霉素(1.6 μg/mL,48 h)重复筛选转基因表达细胞,最终得到表达钙指示蛋白GCaMP6f的NPCs。作者利用BDNF(脑源性神经营养因子)、cAMP(环磷酸腺苷)、Laminin(层粘连蛋白)、Wnt3A和抗坏血酸诱导亲本和表达GCaMP6的NPCs分化,以富集海马齿状回(DG)颗粒神经元。结果显示表达GCaMP6的NPCs(P6代)可见Nestin、Sox2阳性,仍拥有干性,其分化潜能不受影响,可定向诱导分化为成熟神经元,表达MAP2,并表达海马齿状回颗粒细胞标志蛋白PROX1和CALB1。
图3.表达GCaMP6的神经祖细胞能被诱导分化为成熟神经元。
Parental为未转入GCaMP6的对照组。
在不表达GCaMP6的亲本NPCs中加入钙离子荧光探针Fluo-4(荧光染料)指示钙信号,GCaMP6组和Fluo-4组都未见显著的自发钙瞬变,而加入三磷酸腺苷(ATP)、溶血磷脂酸(LPA)或低浓度胰蛋白酶(Try)后两组都检测到显著的钙信号。此外,离子霉素(钙离子载体,Iono)用来作为阳性对照激活钙信号,钙螯合剂EGTA用来去除背景信号。
图4.配体诱导表达GCaMP6的NPCs产生钙信号。
研究人员分别将亲本及表达GCaMP6的NPCs诱导分化4-5周得到人DG颗粒细胞,结果显示GCaMP6组和Fluo-4组均表现出显著的自发钙信号活动。此外,向培养基中添加KCl(50 mM)引起膜电位变化后(诱发动作电位),两组分化的DG神经元完全有反应(实际上是100%,对细胞内钙浓度变化的响应),出现明显的钙信号。而添加电压门控钠离子通道抑制剂河豚毒素(TTX,100 µM)后自发钙火花消失。