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技术与服务

RNA编辑递送工具服务

RNA编辑是细胞内一种精细的生物学过程,它通过对已经转录的RNA分子进行碱基的插入、删除或替换等修改,调节蛋白的表达与功能。与DNA编辑不同,RNA编辑不改变基因组DNA序列,避免了DNA编辑可能带来的潜在风险,如脱靶效应导致的基因组不稳定性和意外的基因突变。因此,RNA编辑因其独特的优势(安全性)成为生物医学领域的热点。

RNA编辑技术-CRISPR/Cas13介导的RNA降解

VI CRISPR/Cas(CRISPR/Cas13)系统是能够降解RNA的基因编辑工具,其中Cas13d蛋白在哺乳动物细胞的RNA降解过程中显示出更强的特异性和更高的敲除效率。CRISPR/Cas13d系统由Cas13d蛋白和sgRNA两部分组成,Cas13d蛋白能够切割单链RNA,而sgRNA能够与Cas13d蛋白结合指导其识别和剪切目标RNA(图1)。枢密科技利用CRISPR/Cas13d系统,已成功在哺乳动物细胞中成功实现RNA敲降。


图1 RNA editing Mechanism (PMID: 33203452)


应用案例展示

1.利用Cas13特异性敲降CircRNA:RfxCas13d是circRNA干扰的最佳系统,通过使用跨越BSJ位点的gRNAs靶向序列,具有最高的干扰效率,并且对其同源mRNA没有可检测的影响。与shRNA及siRNA介导的circRNA敲除相比,RfxCas13d BSJ gRNA系统显示circRNA干扰的更高效率,并具有更高的目标序列保守性,更加高的特异性。(PMID:33288960)




图2 RfxCas13d-BSJ-gRNA系统可以高效敲降circRNA而不影响mRNA (e)对比RfxCas13d-BSJ-gRNA与shRNA在敲低circRNA时特异性及效率。(f)以circPOLR2A为例,展示gRNA间隔序列的精确设计(覆盖BSJ位点),并通过qRT-PCR验证其对circRNA和线性mRNA的差异化调控效果。


2.MECP2重复综合征治疗:MECP2是一种罕见且致命的X连锁神经发育障碍性疾病,由X染色体上MECP2基因重复导致的MeCP2蛋白过表达引起。利用AAV递送RNA编辑工具hfCas13Y及靶向MECP2基因的sgRNA,在小鼠模型中实现了大脑内hfCas13f和MECP2sgRNA的稳定、持久表达。试验结果表明该系统可以显著降低了大脑MECP2基因的表达水平,显著改善了MDS小鼠的运动功能,焦虑抑郁样行为等。(PMID:39668251)目前该药物的临床试验已正式启动(NCT06615206)。



 

图3 通过AAV-hfCas13Y RNA编辑系统实现MECP2体内敲低效率(a)AAV载体设计结合不同hfCas13Y和MECP2 gRNA。(b)将不同AAV载体注射至6周龄野生型C57B6L小鼠海马体DG区过程。(c)注射AAV 4周后,通过qPCR检测小鼠海马体中hfCas13Y AAV基因组DNA的量。(d)注射AAV 4周后,通过RT-qPCR检测小鼠海马体中Mecp2mRNA的表达水平(e,f)通过WB检测小鼠海马体中MeCP2、HA和GAPDH的表达(e),并定量MeCP2蛋白水平。

RNA碱基编辑技术

RNA碱基编辑技术是一种通过特定酶或编辑因子对mRNA上的碱基进行修饰的技术,从而改变蛋白质的合成过程。根据编辑机制的不同,RNA碱基编辑技术主要分为三种类型:A-I编辑、C-U编辑和U-ψ编辑。其中,A-I编辑利用腺苷脱氨酶(ADAR)将RNA中的腺苷(A)转化为肌苷(I);C-U编辑通过APOBEC3A或ADAR2变体实现胞嘧啶(C)到尿嘧啶(U)的转换;而U-ψ编辑则利用H/ACA盒小核糖核蛋白复合物(snoRNP)将尿嘧啶(U)转化为假尿嘧啶(ψ),用于抑制提前终止密码子导致的翻译终止(图4)。由于RNA编辑是在RNA水平上进行的,不会对基因组序列造成永久性改变,因此具有较高的安全性和可逆性。这一特性使其在生物医学领域展现出广阔的应用前景,尤其是在疾病治疗和基因功能研究中。枢密科技利用RNA编辑技术,已在哺乳动物细胞中成功实现RNA编辑。



图4 RNA Base editing Mechanism (PMID: 38418907)


应用案例展示

Hurler综合征治疗:通过AAV递送环状ADAR招募RNA(circ-arRNA)递送到人源化IDUAW402X小鼠模型中恢复α-L-艾杜糖苷酶活性。图5(PMID: 37672590)


 

图5通过腺相关病毒(AAV)递送环状反义RNA(circ-arRNA),在人源化IDUAW402X小鼠模型中恢复肝脏和大脑的α-L-艾杜糖醛酸苷酶活性。A给药时间表和取样示意图B注射AAV-PHP.eB 6周后,人源化Hurler综合征小鼠中枢神经系统(左)和各器官(右)的IDUAW402X转录本编辑率;C使用4-甲基伞形酮IDUA底物检测中枢神经系统(左)、各器官(中)和血清(右)的IDUA蛋白催化活性;D AAV-PHP.eB感染6周后中枢神经系统(左)和各器官(右)的GAG含量;E不同脑区IDUAW402X转录本的旁观编辑NGS结果;F不同组别小鼠肝脏的苏木精-伊红染色。红色箭头指示因GAG积累形成的泡沫状巨噬细胞

服务内容

服务类型

适用技术*

技术应用场景

交付规格**

RNA edit质粒

• CRISPR/Cas13 RNA编辑技术

• A-I RNA编辑技术

• 基因敲降

• 单点突变

• 标准规格质粒:100 μg

• 根据客户需求

RNA edit

PiggyBac质粒

• CRISPR/Cas13 RNA编辑技术

• A-I RNA编辑技术

• 基因敲降

• 单点突变

• 标准规格质粒:100 μg

• 根据客户需求

RNA edit

慢病毒(Lv)

• CRISPR/Cas13 RNA编辑技术

• A-I RNA编辑技术

• 基因敲降

• 单点突变

• 标准规格病毒:1*108 TU

• 根据客户需求

RNA edit

腺病毒(Adv)

• CRISPR/Cas13 RNA编辑技术

• A-I RNA编辑技术

• 基因敲降

• 单点突变

• 标准规格病毒:1*1010 PFU

• 大包装规格病毒:1*1011 PFU

• 超大包装规格病毒:1*1012 PFU

• 根据客户需求

RNA edit

腺相关病毒(AAV)

• CRISPR/Cas13 RNA编辑技术

• A-I RNA编辑技术

• 基因敲降

• 单点突变

• 标准规格病毒:1*1011 GC

• 大包装规格病毒:1*1012 GC

• 超大包装规格病毒:1*1013 GC

• 根据客户需求

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