溶瘤病毒改造服务介绍-服务武汉枢密脑科学技术有限公司

服务

溶瘤病毒改造服务介绍

服务内容

1.牛痘病毒（Vaccinia virus，VACV）

牛痘病毒（Vaccinia virus，VACV）是体积最大、结构最复杂、有包膜的双链线性DNA病毒，长度约190 kb，可编码约200个基因。病毒粒子呈砖形，大小约为300x240x120 nm。病毒宿主范围广，可插入外源基因容量大；VV病毒在细胞质内复制增殖，不整合到宿主细胞基因组内。

图1 牛痘病毒结构示意图（PMID:15249657）

目前VV毒株株型中Western Reverse株、Lister株、Wyeth株和Copenhagen株具有溶瘤特性，其中Western Reverse株溶瘤特性最强。

枢密科技可设计生产缺陷型牛痘病毒，即对Western Reverse（WR）株进行特定基因位点敲除，如J2R（TK）、A56R（血凝素）、F14.5等基因，能够使其在正常细胞中不能有效复制且具有肿瘤选择性，同时插入外源基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-6（IL-6）等可以增强免疫反应。为了进一步提高其肿瘤靶向性和安全性，可按照客户需求进行牛痘病毒基因改造。

2. 单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）

单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）是一种有包膜的大型双链 DNA 病毒，其基因组大小范围为 150 至 240 kb，编码约90个病毒蛋白，平均直径180nm，其中包括一个125 nm的二十面体衣壳。常用HSV载体分为可复制性溶瘤载体和复制缺陷型基因治疗载体。

图2 HSV-1结构（A Handbook of Gene and Cell Therapy）

枢密科技拥有oHSVs的重组改造、拯救、扩增等技术。通过此技术，我们可以根据客户需求，设计最优路径，灵活高效地实现oHSVs突变和重组毒株的构建。例如，对常用oHSV-1病毒的ICP34.5（RL1）、ICP47、US11、TK等特定基因进行敲除，使其具有肿瘤选择性。另一方面，在特定位点插入外源基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL12等增强免疫反应。为了进一步提高其肿瘤靶向性和安全性，我司可根据客户需求对HSV-1进行改造。我司拥有HSV-1毒株种类有KOS株、F株、H129株。

3.水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）

水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）是一种有包膜非分段负链RNA病毒，属于弹状病毒科，其自然宿主为马、牛和猪等。病毒基因组由负向单链RNA组成，长度约为11 kb，包含5个基因，其两侧为3'-前导序列和5'-尾随序列。基因组顺序为3'-前导-核衣壳蛋白(N)-磷蛋白(P)-基质蛋白(M)-糖蛋白(G)-大聚合酶蛋白(L)-尾随-5'。

图3 VSV结构（PMID：34578125）

枢密科技拥有来源清晰的Indiana VSV毒株，拥有成熟的基于反向遗传学的oVSVs重组改造、拯救及扩增技术。通过此技术，我们可以根据客户需求，设计最优路径，灵活高效地实现定制oVSVs突变和重组毒株的拯救。

4.呼肠孤病毒（reovirus，ReV）

呼肠孤病毒科是分布最广的病毒类群之一，其中哺乳动物正呼肠孤病毒（Mammalian Orthoreovirus，MRV）属于正呼肠孤病毒属，主要感染哺乳动物的呼吸道和肠道。完整的病毒粒子为二十面体，直径约为60~80 nm，无囊膜；病毒核酸大约为18~27 kb，由双层蛋白质衣壳包裹（图1）。

图4 呼肠孤病毒（Reovirus）结构

枢密科技拥有血清3型呼肠孤病毒毒株，可以对其进行改造，如：1、修饰病毒衣壳；2、导入特异性启动子；3、将抗癌基因插入病毒基因组；4、将免疫刺激因子如GM-CSF插入病毒基因组等方式，进而能够特异性感染并杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞功能。为了进一步提高其肿瘤靶向性和安全性，可按照客户需求对oReV进行改造。

5. 腺病毒（Adenovirus，AdV）

腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种无包膜的、直径约为70-90 nm的双链DNA病毒（图1），其基因组大小约为36kb，分为早期（E1A，E1B，E2，E3，E4）、中期（IVa2，pIX）和晚期（L1-L5）转录单元（图2）。腺病毒有50多种血清型，其中的常用血清型为Ad5。腺病毒具有组织嗜性和感染分裂和非分裂细胞的能力，常用的AdV载体分为条件复制型（Conditionally Replicating Adenovirus，CRA; oAd）和复制缺陷型腺病毒（Replication-defective Adenovirus）载体，广泛应用于预防性疫苗、治疗性疫苗以及溶瘤病毒领域。

图5 腺病毒结构（Viral zone网站）

腺病毒作为溶瘤病毒常用的一些改造位点有：E1A-CR2、E1B-55K、E1B-19K等，以及通过肿瘤组织特异性启动子驱动E1A等来增加病毒的靶向性，或者作为载体构建外源免疫相关基因，如IL-12，IFN-γ，GM-CSF等，并结合放疗/化疗的传统疗法或结合单抗或CAR-T等生物疗法，通过多种途径的协同作用对肿瘤细胞进行杀伤。

枢密科技拥有来源清晰的人血清5型腺病毒（Ad5）毒株和复制缺陷型腺病毒包装系统，可以进行如下改造：1、对腺病毒的结构基因进行改造；2、E1基因插入肿瘤特异性启动子；3、E1A-CR2、E1B-55K、E1B-19K改造；4、携带治疗基因等。为了进一步提高其肿瘤靶向性和安全性，也可按照客户需求进行溶瘤腺病毒定制改造。

服务流程

客户提供：(1)病毒毒株或种类；(2)病毒基因组改造位点及改造类型；(3) 病毒滴度和总量需求

服务周期

HSV-1/VACV/AdV （按照常规病毒总量1E+9 PFU）			VSV（印第安纳株）/ ReV
服务内容		周期（工作日）	服务内容	周期（工作日）
分子克隆	1、常规重组载体	10	分子克隆（基因合成额外收费）	20
	2、插入指定基因	15（合成周期另算）
重组、挑斑、纯化（一步重组）		35	病毒拯救	30
初鉴定		5	初鉴定	5
重组病毒扩增、浓缩		5	重组病毒扩增、浓缩	10
产品质检报告（分子鉴定）		5	产品质检报告（分子鉴定）	5

交付内容：病毒、荧光图、滴度测定报告、凝胶电泳PCR扩增鉴定报告。如有特殊需求，如病毒全基因组测序报告，价格和周期相应调整。