利用基因编码钙指示剂(genetically encoded calcium indicators,GECIs)测量神经元活动已成为神经科学中广泛使用的方法，GECIs进行钙成像通常用于测量完整神经系统的神经活动，如检测大量神经元胞体的活动，或追踪神经元亚细胞(如轴突、树突和单个突触)的动态。尽管取得了重大进展，但钙成像仍然受到现有GECIs的生物物理特性的限制，包括亲和力、信噪比、灵敏度、半衰期以及动态范围，因此，GECIs在这些方面还有待改进。2019年6月17日，来自霍华德休斯医学研究所的Karel Svoboda、Loren Looger和Vivek Jayaraman等课题组合作的“GENIE项目组”在顶级期刊《Nature Methods》上发表了题为“High-performance calcium sensors for imagingactivity in neuronal populations and microcompartments”的研究成果。该论文系统地介绍了新一代基因编码的钙离子探针jGCaMP7系列，专门用于检测特定环境下的神经元活动。jGCaMP7包括:jGCaMP7s(灵敏)、jGCaMP7f(快速动力学)、jGCaMP7b(较亮的基线荧光)和jGCaMP7c(高对比度)。jGCaMP7在体内和体外都进行了测试，其性能明显优于GCaMP6。

研究人员利用在存在或不存在Ca2+时GCaMP的晶体结构，确定了可能影响指示剂关键性质的位置，包括静息荧光和峰值荧光，以及结合和不结合Ca2+的亲和力和动力学。GCaMP包括一个与钙调蛋白(CaM)融合的环状排列GFP(cpGFP)和一个来自肌球蛋白轻链激酶(Rs20，也称为M13)的钙调蛋白结合肽。钙调蛋白依赖的构象变化及其与M13和GFP的相互作用调节GFP发色团环境并影响荧光。对GFP-CaM接口和CaM-M13相互作用接口进行了定点突变(图1a)。通过电极刺激培养的神经元筛选662个变异的jGCaMP7(图1c)，继续在体外特性研究中得到了性能优良的jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b和jGCaMP7c。其中，jGCaMP7s灵敏性可达GCaMP6s的5倍以上，且速率也快于GCaMP6s；jGCaMP7b灵敏度达到GCaMP6s3倍，荧光亮度增强50%；jGCaMP7c灵敏度是GCaMP6s的2.7倍，且对比度增强；jGCaMP7f反应速率是GCaMP6f的5倍及GCaMP6s的3倍(图2)。

图1.分离神经元中jGCaMP7的突变与筛选

图2. jGCaMP7的筛选及体外特性研究

通过优化钙离子探针的Ca2+亲和力同时进一步提高探针的灵敏度、信噪比、半衰期和动态范围，研发出了jGCaMP7系列。追踪神经元亚细胞的动态对神经环路研究具有重要意义，而树突、轴突等亚细胞结构小，jGCaMP6 灵敏度低，成像保真度不高，而 jGCaMP7s，jGCaMP7f，jGCaMP7b很大程度上提高了在不同钙离子浓度下的灵敏度，jGCaMP7f 同时具有较快的反应速率，这对于神经元亚细胞的动态检测非常重要。

研究人员随后在在体水平验证了jGCaMP7。在检测jGCaMP7在成年果蝇椭球体神经元的表现中，检测对于闭环视觉刺激下的运动果蝇的树突神经活动，通过双光子成像发现jGCaMP7f相比GCaMP6f表现出更高的检测灵敏度(图3)。通过对小鼠初级视觉皮层双光子成像中，发现jGCaMP7b相比于GCaMP6s能够在更多的树突棘中检测到对视觉刺激的反应(图4)。

图3. jGCaMP7在成年果蝇椭球体神经元中的表现

图4. 树突棘中钙信号的检测

目前jGCaMP7已经被广泛用于线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等多个模式生物的研究。未来GCaMP的改进可能需要最大限度地增加其荧光强度，这将需要对GCaMP骨架进行重大改变，例如用更明亮的荧光蛋白取代cpGFP，用cpGFP发色团重新设计CaM-M13接口，或者使用完全不同的荧光基团。

Hod Dana. et al. High-performance GFP-based calcium indicators for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. bioRxiv 434589, Oct. 3, 2018.

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/434589v1