AAV/LV介导基因过表达-产品武汉枢密脑科学技术有限公司

应用领域

AAV/LV介导基因过表达

原理

基因过表达是将目的基因的编码区克隆到相应的工具病毒载体上，导入细胞使基因实现大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。此外，还可选择报告基因进行目的基因表达的追踪。

AAV简介

腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），病毒颗粒无包膜，结构为直径约20 nm的正二十面体，是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体，极大增加了AAV的应用潜力。研究中采用的重组腺相关病毒（Recombination adeno-associated virus,rAAV）载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

表1靶向不同的器官及组织推荐使用对应AAV血清型、启动子及注射方式

类别	感染部位	注射方式	启动子	血清型
CNS(部分脑区，经验值)	VHPC	脑立体定位注射	广谱启动子	2、5、8、9
	NAC	脑立体定位注射	广谱启动子	2、5、8、9
	DG	脑立体定位注射	广谱启动子	2、5、8、9
	VTA	脑立体定位注射	广谱启动子	2、5、8、9
	全脑	侧脑室小脑延髓池	广谱启动子	9、phpeb
		尾静脉，颈静脉/颈动脉	广谱启动子	phpeb
		眼球后静脉	广谱启动子	9、phpeb
	脊髓	鞘内注射	CMV	9
PNS	眼睛	玻璃体腔注射/视网膜下腔注射/晶状体	CAG,视网膜特异性启动子rpe65	2、anc80L65(视网膜),shH10(视网膜穆勒细胞)
	肺	鼻吸/气管注射	CMV、CAG	6.2、6
	胰腺	腹腔注射	CAG	8、pan
	肾脏	尾静脉/肾动脉、肾静脉和左髂脉、腹主动脉	CMV	2、9
	肾脏	肾盂原位注射	CMV	2、9
	肠道	肠系膜上动脉注射灌肠	CAG	8、9和10
	骨髓	骨髓腔		9
	心脏	尾静脉/颈静脉注射	cTNT	9
	心脏	心内腔注射心肌内定点注射	CMV、cTNT	9
	脾脏	静脉注射		6
	卵巢	腹腔注射	CMV、CAG	2
	睾丸	上后肢注射/睾丸注射	CMV、CAG	2
	骨骼肌	静脉注射		8、9
		胫骨前(tibialis anterior )	CMV	8、9
		肌肉注射(后肢的股四头肌，腓肠肌和胫骨颅骨肌)		1、6
	骨骼肌	静脉注射	CAG,骨骼特异性启动子Col2.3,Sp7	8
	肝脏	尾静脉注射	TTR,TBG,EF1a	8
		肝内注射
		腹腔注射
	脂肪	尾静脉	脂肪特异性启动子FABP4(aP2)	8、9
		内脏脂肪-腹腔内注射	CMV	8、9
		皮下脂肪-皮下注射	CMV	8、9
	耳	耳朵/圆窗膜round window membrane (RWM)	CMV、CAG	anc80L65、ie、8
	血管	腹主动脉局部感染	CMV	1、5
	滑膜关节	关节		5
	平滑肌	尾静脉/气管	SM22a	1、2

rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。AAV的总包装容量是4.7 kb，目的基因长度要求不超过3.5 kb。

慢病毒简介

慢病毒是逆转录病毒科的一个属，属于单链RNA病毒，是在人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）的基础上发展起来的病毒载体，能够有效感染分裂细胞和非分裂细胞，整合到宿主基因组上实现长期稳定表达。慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右(还取决于载体本身是否有其他抗性基因或报告基因)。一般而言插入的片段如果在5kb以下产生的病毒滴度比较高，当插入的片段大于6kb的时候得到的病毒滴度往往不高。如果除去一般携带的抗性基因和报告基因，则往往只余下3kb左右的容量供目的片段的插入。我司通过载体改造去除一些不必要基因，在一些特殊情况下，可以最大插入7kb的基因片段。

应用

图1. 5种血清型AAV载体不同注射量基因表达效果

颈静脉注射cTnT启动表达eGFP的5种血清型AAV载体，4周后心脏冰冻切片荧光检测显示AAV9 1×1011vg病毒量时eGFP在心肌细胞表达最强。

参考文献：

Prasad KM, Xu Y, Yang Z, et al. Gene Ther. 2011.

图2. miR-30d表达水平

在MI（心肌梗死）手术前1周的开胸手术中单点心肌注射25μL过表达miR-30d慢病毒，结果显示术后三周心脏中miR-30d水平增加2倍。

参考文献：

Li J, Salvador AM, Li G, et al. Circ Res. 2021.

基因表达调控-基因稳定过表达及敲低

CRISPR/Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域：RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时，Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9(dead Cas9)。CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子（如VP64、VPR、SAM或SunTag）或转录抑制因子（如KRAB）融合后，结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。

图1 CRISPR-dCas9系统调控内源基因（Gilbert et al., Cell, 2013）

应用

CRISPR-dCas9转录激活：可实现目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC、激活沉默基因、遗传缺陷补偿等;

CRISPR-dCas9转录抑制：可实现抑制目的基因表达、分析代谢途径、敲低特定基因转录量以研究基因功能、可与CRISPR/Cas9 Gene Knockout或RNAi技术联合作用等。