杆状病毒-服务武汉枢密脑科学技术有限公司

服务

杆状病毒

简介

杆状病毒 (baculovirus) 是一种双链环状DNA病毒，基因组大小在88~160Kb，其DNA分子呈超螺旋状折叠，外被囊膜包裹。现已发现的杆状病毒可达700种，它们对宿主范围的要求苛刻，具有很强的专一性，主要在节肢动物中存在感染和传播现象。杆状病毒粒子被包裹在蛋白晶体结构中，根据包裹的蛋白晶体结构的差异，可将其分为核型多角体病毒和颗粒体病毒。其中家蚕核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒是最具代表性杆状病毒，也是目前应用最广泛，研究最深入的两种杆状病毒。

杆状病毒中已经被鉴定的基因达70多种，其中p10 ( p10 promoter, Pp10)和polh启动子 (polyhedrin promoter, PPH) 是昆虫杆状病毒表达系统中使用最广泛的启动子，具有较强的启动子活性。整个杆状病毒基因的表达过程是一个级联过程，前一时期的基因有效地调控着其后期基因的表达，DNA复制在这个过程中起着中心环节的重要作用。

杆状病毒生命周期中存在两种病毒表型：即芽生型病毒粒子 (budded viruses BV) 和包埋型病毒粒子 (Occlusion derived virus ODV)，或称为多角体来源型病毒粒子 (Polyhedron-derived virus PDV ) 。PDV表型的病毒粒子通过病毒包膜与中肠上皮细胞微绒毛融合，在中肠细胞，核衣壳被运输到细胞核中，病毒粒子侵入8h期间，细胞核增大并产生病毒的基质。12h后一些子代核衣壳开始通过核膜发芽。在细胞质中，从核膜获得的包膜丢失，核衣壳经质膜运输出芽。而BV表型病毒粒子可感染多种类型细胞，在受感染的细胞中出现了两种途径：病毒粒子从细胞核进入细胞质经出芽形成了BV型病毒，或者被包埋在细胞核中封闭形成PDV型病毒。在BV表型的病毒粒子中，近60个ORF为非必需，对这些序列进行替换删除将不影响杆状病毒生命活性，这为构建和改造可用于表达外源蛋白的杆状病毒表达系统 (Baculovirus Expression Vector System, BEVS) 提供了可能。

杆状病毒表达系统 (Baculovirus Expression Vector System, BEVS) 是以昆虫杆状病毒为外源基因载体，昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。该系统具有以下优势：

1. 昆虫细胞与哺乳动物细胞翻译和翻译后蛋白修饰的模式与能力相似，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段切割和分解等，得到的重组蛋白抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似；

2. 能容纳大分子片段的插入；

3. 容易实现大规模低成本生产。

目前该系统广泛应用表达一些可能对哺乳动物宿主细胞产生副作用的蛋白，如激酶以及毒性蛋白等。

目前最常用的表达系统有以下几种：

1. Bac-to-Bac表达系统

该系统采用杆状病毒穿梭载体，利用转座子 Tn7 位点特异的转座作用，使转移载体和杆状病毒 DNA 在大肠杆菌中生成重组杆状病毒杆粒。随后，将重组杆状病毒杆粒转染到昆虫细胞内，生成重组杆状病毒。

2. Baculo Direct 系统

线性化的杆状病毒 DNA 两端含有 attR 位点，且两 attR 位点间有 HSV1 tk 基因，目的基因通过 Gateway 技术克隆到入门载体上，通过 LR 反应的重组 DNA 转染昆虫细胞，经更昔洛韦（ganciclovir）负选，得到含目的基因的重组病毒。

3. BacPAK6 和 BaculoGOLD 系统

这两个系统都是将杆状病毒 DNA 经 Bsu36 I 酶切后线性化，核衣壳编码基因的 ORF1629 部分缺失，不能在昆虫细胞中复制，和转移载体共转染昆虫细胞后，通过同源重组，缺失的复制必需基因和外源基因一起重组到病毒 DNA 后，才能存活。但有时会有 AcNPV DNA 线性化不完全，重组后仍需要通过空斑实验筛选重组杆状病毒。

4. Flash BAC 系统

第二代杆状病毒表达系统，该系统缺失了 AcNPV DNA 复制必需基因（核衣壳编码基因的 ORF1629）的一部分，用一段人工合成的基因（bacterial artificial chromosome，BAC) 替代多角体编码区，改造后的环状杆状病毒不能在昆虫细胞中复制，当与转移载体共转染昆虫细胞后，通过同源重组重新获得复制必需基因片段并将目的基因转移到杆状病毒基因组中，只有发生同源重组的病毒才能在昆虫细胞中复制，从而实现在昆虫细胞中一步法生产重组杆状病毒，无需进行任何筛选。因为重组原理相同，其中 flashBAC，BacPAK6 和 BaculoGOLD 这三个系统的转移载体可以互换使用，方便各杆状病毒表达系统之间的互换和尝试。（来源：丁香园）

应用

1. 蛋白表达

2. 动物疫苗研制

3. 杆状病毒表面展示技术的应用

4. 基因治疗

5. 病毒样颗粒包装

服务内容及周期

实验内容	周期	交付数据及材料
载体构建	3-5周	酶切/测序验证报告；含表达质粒的DH10; 表达质粒
杆粒及P1代病毒制备	1-2周
杆粒及P2代病毒制备	1-2周	P2代表达鉴定报告
小样纯化(500ml-2L)	1-2周	蛋白样品(可提供50-500ug蛋白),也可直接提供表达后细胞
扩大培养及蛋白纯化(10L以上)	3-5周	蛋白纯度鉴定报告；成品蛋白(依据表达小试结果约定)

案例展示

胞外分泌运用实例

胞內表达运用实例