水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV) 属于弹状病毒科(Rhabdoviridae) 水疱病 毒属(Vesiculovirus) ,是有囊膜的单股负链RNA 病毒。野生型VSV 具有顺向跨突触传播的特性，能感 染多种动物和昆虫，可以用于灵长类及啮齿类动物神经解剖学的研究。基于这类病毒对人及动物的低危 害性，已经被广泛用于疫苗和基因载体的开发。VSV 作为嗜神经工具病毒，感染神经元后，在极短时间 内高丰度地表达目的蛋白。感染细胞后，其第一批子代病毒最快只需1.5 h 即可被释放出来。van den Pol 等通过构建囊膜糖蛋白缺失且携带GFP 报告基因的dG-VSV ，在病毒感染细胞1 h 之后即可检测到报告 基因的表达。Beier 等测试了VSV 对啮齿类大脑的感染特性，发现其具有顺行跨突触能力，同时也具有 神经元感染的高度特异性，可被其他病毒的囊膜糖蛋白包装而获得不同方向的跨突触能力。他们发现VSV 利用其本身的囊膜糖蛋白(VSV-G) 包装可顺向跨突触感染神经环路；同时，用RV 的囊膜糖蛋白RV-G 替 换VSV 的囊膜糖蛋白VSV-G 之后，病毒可获得逆向跨突触感染神经环路的特性。2013 年，Beier 等又 对VSV 进行了一系列的改造工作，利用类似RV 跨单突触系统的设计方法，实现了基于VSV 对特定神经 网络进行跨单级和跨多级的顺向和逆向标记。

VSV的囊膜糖蛋白（glycoprotein，G）是其顺向跨突触所必需的蛋白， G蛋白缺失的VSV（VSV- ΔG）会丧失跨突触能力，而其基因组的复制及转录不受影响（可继续高丰度表达外源基因），通过在被 VSV-ΔG 感染的神经元中外源补偿VSV 的G 蛋白，VSV-ΔG 可重获顺行跨突触能力从而感染下一级神经 元，而在下一级神经元中由于缺少G 蛋白的补充，VSV-ΔG 不能继续跨突触传播，从而可利用VSV-ΔG 实 现可控的跨单级神经突触标记神经网络。禽类肉瘤病毒(Aviansarcoma-leukosisvirus,ASLV) 的外膜蛋 白(EnvA) 可通过识别其同源的病毒受体TVA 介导病毒特异性地感染细胞，而TVA 只存在于禽类细胞中， 在哺乳动物神经元中无表达。利用EnvA 膜外区与跨膜区及RV 的G 蛋白胞内区融合得到的重组囊膜蛋白 包装缺陷型的VSV-ΔG（VSV-EnvA-ΔG），其感染神经元需要TVA 的表达，而其跨突触需要G 蛋白的补偿。 结合特异的表达Cre 重组酶的转基因动物品系及Cre-LoxP 系统，通过立体定位注射AAV ，可实现只在 特定区域特异类型神经元中表达TVA 及G 蛋白（VSV-G或RV-G），从而利用VSV-EnvA-ΔG 实现对特异类 型神经元的顺向或逆向跨单级突触标记。此外，在利用AAV 介导特异类型神经元表达TVA 及VSV-G 蛋白 的同时，使该神经元中表达一种荧光蛋白，如，GFP；而使VSV-EnvA-ΔG 表达另一种荧光蛋白，如，RFP， 则起始感染的特异类型神经元可同时被标记为绿色和红色（黄色），而其直接输出的下一级神经元会被 标记为红色，从而可对特定类型神经元本身与其下游游神经元进行区分。在此基础上，使VSV 带上CHR2 及Gcamp 等基因，可实现对特异类型神经元的直接输出网络进行功能操纵及活动监测。

首先将AAV-EF1α-DIO-GFP-TVA 与AAV-EF1α-DIO-VSVG 按照特定比例混合，然后向在特异 神经元中表达Cre的转基因小鼠目标脑区立体定位注射AAV 混合病毒。待AAV 病毒充分表达两周以上， 即可在同一区域立体定位注射VSV-EnvA-ΔG-dsRed，VSV 注射后12-14 h ，可对动物心脏灌注，利用4% PFA固定后取出脑组织制备样本观察标记结果。

1、我们提供的AAV 目前均为2/9型或5型，病毒滴度均约为1X10E12 v.g / mL，推荐的病毒 混合比例为AAV-EF1α-DIO-GFP-TVA 与AAV-EF1α-DIO-VSVG （或AAV-EF1α-DIO-RVG）按照体积比1：2 混合。

2、推荐的注射体积为混合后的总体积100-300 nL，注射速度为20-50 nL/min。若目标核团较小 或Cre 在该区域的外周围也有较多表达，为控制起始感染区域的特异性，可适当降低注射AAV 病毒的体 积及速度；反之，如需标记大范围或Cre 只在局部区域高特异性表达，可增加AAV 注射的体积与速度。

3、为保证VSV-EnvA-ΔG-dsRed 注射时已有高丰度表达的TVA 介导其感染神经元及G 蛋白补偿其跨突触 能力，AAV注射后需表达两周以上六周以内再注射VSV-EnvA-ΔG-dsRed，六周以外未进行相关实验评估， 但可尽量缩短 AAV 感染时间以缩短实验周期及避免 AAV 过表达外源TVA 及G 蛋白导致的细胞毒性及神经网络改变；VSV 注射后，一般以12 h 为标准时间牺牲动物，而此时间也可控制在2-3天，对跨 突触标记结果无太大影响（所有实验样本都需保证采用一致的时间窗口）。

图2： VSV病 毒的跨突触追踪策略 。

（A）编码绿色 荧光蛋白等报告基因的rVSV 对特定神经网络进行跨单级或跨多级的逆 向或顺向标记。初始感染的细胞用星号表示。基因组包含G 蛋白的VSV 可以进行跨多突触传播。传播的方向取决于糖蛋 白的特性。感染的神经细胞用绿色标出。在一些情况下， 将TVA（带红色标签，mCherry）、G同时导入同一个起始神经 元中，再用EnvA 包装的携带绿色荧光蛋白GFP 基因的EnvA-VSV-GFP 可以特定感染这类起始神经元，在起始神经元中组 装成成熟的病毒粒子，感染上一级（逆行）或下一级（顺行）神经元，在上一级或下一级神经元中，只能进行RNA 复制 并表达外源蛋白，但不能产生成熟的病毒粒子继续跨突触感染，实现重组的VSV病毒按特定的方向传输。