血管是指血液流过的一系列管道。血管内皮是血流和血管壁之间的界面。除角膜、毛发、指(趾)甲、牙质及上皮等地方外,血管遍布人体全身。血管从管腔面向外依次为内膜、中膜和外膜。按构造功能不同,血管分为动脉血管、静脉血管和毛细血管三种。
血管内皮细胞功能
人体血管内皮细胞覆盖于血管内膜表面,是一种单层扁平上皮细胞。血管内皮细胞是作为血管壁与血液之间的天然屏障。完整的血管内皮细胞为血液中的凝血因子、抗凝因子以及血小板之间的相互作用提供了光滑的表面,同时参与凝血、抗凝及纤溶(纤维蛋白溶解)系统,便于维持凝血和抗凝之间的平衡状态,保证血液在血管内正常流动。内皮细胞合成和释放许多局部调节通透性、血管张力、平滑肌细胞生长和迁移、炎症反应和血小板功能的因子。组织损伤时白细胞从血液中通过血管内皮迁移到组织中去。在急性炎症情况下,中性粒细胞粘附到内皮细胞上,白细胞先迁移后渗出,然后向血管外迁移。血管内皮细胞还具有促进先天性和后天性免疫系统与血管壁相互作用的功能。
内皮细胞功能性障碍疾病
内皮细胞和血管系统的改变在人类最可怕的疾病的发病机制中起着中心作用,因为内皮细胞具有维护毛细血管通畅和功能的关键作用。内皮细胞直接参与外周血管疾病、中风、心脏病、糖尿病、胰岛素抵抗、慢性肾衰竭、肿瘤生长及转移、静脉血栓形成以及严重的病毒感染性疾病。内皮细胞的功能性障碍是动脉粥样硬化的先兆,也会导致动脉血栓的形成。
健康内皮(A)和功能失调内皮(B)。健康的内皮显示血管舒张表型,包含高水平的血管舒张剂,如一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2),以及低水平的活性氧(ROS)和尿酸。健康的内皮还具有由低水平的纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)、血管性血友病因子(vWF)和P-选择素(又名CD62P)组成的抗凝表型。可溶性血管细胞粘附分子(sVCAM)、可溶性细胞间粘附分子(sICAM)、E-选择素(CD62E)、C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的低水平表明可能存在很少的炎症。最后,内皮祖细胞(EPCs,表明血管修复能力)的数量很高;而内皮微颗粒(EMPs)和循环内皮细胞(CECs)的水平很低,表明内皮压力/损伤。在内皮功能失调的情况下,其表型特征包括血管扩张受损,氧化应激、尿酸、过氧化脂质自由基、硝基酪氨酸和一氧化二氮增加,以及促凝血和促炎症表型,血管修复能力下降,EMPs和CECs数量增加。
工具病毒在血管内皮中的应用
案例一:利用AAV载体在视网膜血管内皮进行基因编辑
AAV载体在血管内皮细胞中基因治疗的应用
案例二:利用脑血管内皮细胞AAV特异性载体治疗新生小鼠色素失调症
通过静脉注射AAV-BR1(展示NRGTEWD肽的AAV2,具有良好的靶向特异性,在脑中转基因表达很强,在非靶向器官中表达很少或没有表达)-CAG-Nemo(6E+10 gp/每只,genomic particles/gp/基因组颗粒)使新生色素失调小鼠(Nemo-/+)的内皮细胞存活和血脑屏障通透性正常化。
研究显示,不同血清型的AAV通过与特定受体结合,具有一定的组织趋向性。基于AAV血清型2(AAV2)的载体表现出广泛的组织和细胞亲和性,但AAV2载体不能有效地转导血管内皮细胞,这是由于硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan sulphate proteoglycans,HSPG)将AAV-2隔离在细胞外基质中,从而阻止细胞进入和对蛋白酶体的敏感性。通过将从噬菌体线性展示中分离的七聚体肽SIGYPLP整合到AAV 2血清型衣壳的I-587位,设计了一个靶向血管内皮的rAAV载体(AAVsig)。
图3. AAVsig介导增强的内皮细胞基因转移。不同剂量的AAVwt和AAVsig感染不同内皮细胞(A:人脐静脉内皮细胞(HUVEC);B:人隐静脉内皮细胞(HSVEC))以及β-半乳糖苷酶表达分析。
如图所示,与传统2型相比,AAVsig对脐静脉内皮表达增加约5.9倍,对隐静脉内皮细胞增加约28.2倍。
有研究通过在AAV 2血清型衣壳的I-587位插入不同的七聚肽重新筛选靶向血管内皮的AAV突变体,结果显示AAV-VSSSTPR(AAV-VEC)和AAV-NNPLPQR(AAV-NEC)两种病毒变体具有很强的选择性,但AAV-VEC的转导效率最高,是AAV2的2.7倍。更重要的是在GOI(Gene of Interest,简称GOI)为10000时,AAV-VEC的转导效率是AAVsig的13倍。
另有研究显示,通过类似的方法在AAV9衣壳位点A589插入两种七肽RGDLRVS和SLRSPPS,以流式筛选荧光确认感染效率,并论证两者对内皮细胞感染情况。
数据显示,在人冠状动脉内皮细胞(HCAEC);人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC);肝肾等来源的永生化细胞(HEK293T,HeLa,911,HepG2)中rAAV9插入肽有效地提升了对内皮细胞的感染效率(SLRSPPS更优),但不具有内皮细胞靶向性。
有研究通过对AAV9血清型进行一系列改造,开发了一种新血清型AAV-BI30。AAV-BI30这种新血清型能够特异且高效地转导整个中枢神经系统(CNS)的内皮细胞。在小鼠、大鼠模型和体外人类微血管内皮细胞中均能稳定表达。
在C57BL/6小鼠静脉注射AAV-BI30(AAV-BI30-CAG-NLS-GFP-WPRE载体,1.00E+11 vg/每只),10d后皮层和海马中可见明显的内皮细胞标记,而较少转导外周器官微血管系统中的内皮细胞。
在相同的注射条件下,AAV-BI30标记的小鼠脑内皮细胞数量明显多于AAV-BR1。同时,AAV-BI30的表达在整个大脑中没有明显的区域间差异,即皮质、海马、丘脑和小脑均表现出>80%的内皮细胞转导。此外,与AAV-BR1不同的是,AAV-BI30具有高度内皮细胞特异性,标记神经元或星胶细胞的情况罕见。
AAV感染血管内皮的方式主要有玻璃体腔注射、动脉注射、静脉注射以及肌肉注射。有研究人员通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射以及皮下注射对AAV感染效率进行评估,发现静脉注射后AAV的感染效率最高。
血清型 |
启动子 |
感染部位 |
注射位点 |
注射方式 |
剂量 |
注射体积 |
AAV2 |
CMV |
颈动脉血管内皮 |
左侧颈动脉 |
动脉滴注 |
2.0E+12 |
100μL |
AAV2 |
HCMV |
胫前肌部位毛细血管 |
胫前肌 |
肌肉注射 |
2.5E+7 IU/只 |
500μL |
AAV1 |
ICAM2 |
视网膜微血管内皮细胞 |
玻璃体腔 |
玻璃体腔注射 |
1E+12 vg/mL |
1μL |
AAV9mut |
ICAM2 |
肝脏血管内皮 |
尾静脉 |
静脉注射 |
2E+10 vg/只 |
|
AAV-BR1 |
CMV |
脑微血管内皮 |
尾静脉 |
静脉注射 |
5E+10 genomic particles/mouse |
|
AAV-BR1 |
cdh5 |
视网膜血管内皮 |
尾静脉 |
静脉注射 |
~1E+12GC/ml |
100μL |
启动子 |
靶细胞 |
小鼠品系 |
CMV |
血脑屏障血管内皮细胞 |
CMV-Cre; tdTomato |
Cdh5 |
视网膜血管内皮细胞 |
Cdh5CreERT2+/-mice |
CMV |
颈动脉血管内皮细胞 |
Cas9-transgenic(Cas9-tg) mice |
Tie2 |
心内膜、主动脉、脐动脉、静脉以及小血管中的内皮细胞 |
Tie-cre mice |
Cadh5 |
动脉、静脉和毛细血管的内皮细胞 |
VE-Cadherin-Cre R26R mice |
血管内皮细胞疾病动物模型:
色素失调症、血管性血友病、动脉粥样硬化、氧诱导视网膜病变。
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