RV逆向跨单突触标记-产品及应用武汉枢密脑科学技术有限公司

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RV逆向跨单突触标记

RV( Rabies Virus，RV)属于弹状病毒科( Rhabdoviridae)狂犬病毒属（Lyssavirus )。野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子，在神经系统中具有传播属性，对人和动物均具有较高致病性。逆行跨单突触产品是狂犬病毒疫苗株改造而来。随着反向遗传学手段的成熟，经过改造的RV，可用于神经回路研究。RV感染中枢系统后，主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞﹔被感染的神经元在一定时间内（ 7-12天）几乎不发生明显病变及裂解。Wickersham等基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆构建的复制缺陷型重组RV具有较低的毒性和较高的安全性，可清晰的标记神经元的精细形态，并通过反向互补策略实现了对神经网络连接的逆向跨单级突触追踪。

基因组及其编码的蛋白

RV为单股负链RNA病毒，病毒粒子长约200 nm，直径约为70 nm。病毒基因组长约12 kb,由3'端至5′端依次排列着N、P、M、G和L共5个狂犬病毒的结构基因，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白。

图1 RV粒子示意图（图片来自whelanlab网站）

生活周期

RV糖蛋白G介导病毒粒子与细胞表面受体结合，通过内吞作用进人细胞。随后通过pH介导膜融合，促使RV基因组释放到细胞质中。感染细胞中病毒粒子内包装的L、N、P共同构成的聚合酶复合物以基因组负链RNA为模板启动转录表达，复制，组装，出芽产生子代病毒。

图2 狂犬病毒生命周期示意图（图片来自维基百科)

逆行及跨单突触标记特性

RV的囊膜糖蛋白( glycopro-tein，G)是其逆行跨突触所必需的蛋白，其受体大量分布在轴突末端，感染后可沿轴突逆行进人神经元胞体开启病毒复制,G蛋白缺失的RV(RV-dG)会丧失跨突触能力，而其复制及转录不受影响（可持续高丰度表达外源基因),因此，RV-dG携带报告基因后,其功能类似CTB,Retrobeads等，可逆向高亮度标记神经元精细形态。另外，补偿RV-G蛋白，可辅助RV-dG逆行跨突触感染上一级神经元，从而实现跨单突触神经网络标记。

适用的神经科学问题

1)特定区域特异类型神经元的全脑单级输人网络标记。

2)两个区域特异类型神经元跨单级输人网络标记。

3)三级连接网络的跨单突触标记。

应用实例

图3 RV-EnvA-dG-EGFP标记效果图

RV-EnvA-dG-EGFP注射位点NAC(A)；AAV-DIO-BFP-TVA和AAV-DIO-RVG注射位点NAC(B)；注射位点NAC Merge(C)；逆向跨单突触区域丘脑室旁核PVA(D)﹔逆向跨单突触区域腹侧海马VHPC(E)；逆向跨单突触区域基底外侧杏仁核后部BLP(F)。( Figure provided by Dr.Fuqiang Xu's lab of Center for Brain Science at WIPM )

图4 RV-DG-EGFP标记效果图

注射位点为腹侧被盖区VTA(A)；逆向投射区域分别为纹状体Cpu(B )，伏隔核Acb( C)，内侧僵核MHb和外侧僵核LHb( D )，背缝核DR (E)和上丘(F)。(Figure provided by Dr.Fuqiang Xu's lab of Center for Brain Science at WIPM)

图5 RV-N2C(G)-DG-XFP标记效果图

C57小鼠病毒注射后1W灌流。A，B，C，D为逆向标记的4个不同脑区的图像采集信息。测试显示：a)注射位点细胞荧光蛋白高表达且无明显炎症反应；b)可逆向标记多个区域；c )逆向投射效率高,标记细胞形态较好,纤维高亮。

产品列表

产品货号	产品名称	携带外源基因	功能
R01001	RV-ENVA-△G-EGFP	EGFP	结合AAV-Helper使用,逆行跨单级,绿色标记
R01002	RV-ENVA-△G-DsRed	DsRed	结合AVV-Helper使用,逆行跨单级,红色标记
R01003	RV-ENVA-△G-GCaMP6s-DsRed	GCaMP6s,DsRed	结合AAV-Helper使用,逆行跨单级,红色标记,钙离子敏感探针
R01004	RV-ENVA-△G-mCherry	mCherry	结合AVV-Helper使用,逆行跨单级,红色标记
R03001	RV-N2C(G)-△G-EGFP	EGFP	逆向绿色标记,不跨突触
R03002	RV-N2C(G)-△G-DsRed	DsRed	逆向红色标记,不跨突触
R03004	RV-N2C(G)-△G-mCherry	mCherry	逆向红色标记,不跨突触