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钙离子探针

钙离子探针

一、原理及应用介绍

     钙成像技术(calcium imaging)是指利用钙离子指示剂监测组织细胞内钙离子浓度的方法。神经元钙成像技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系,利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针(钙离子指示剂,calcium indicator),将神经元中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来,从而达到监测神经元活动的目的。


实施方法

Step1:选择合适的钙离子指示剂。

Step2:将钙离子指示剂转运至目标部位。

     化学荧光指示剂通常采用电极刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式进入到目标部位,而GECI指示剂则主要借助于病毒感染的方式导入至目标部位。

Step3:收集信号,记录结果。

     钙离子荧光信号的检测一般有多种选择,如多通道在体电生理,可记录多脑区,并精确到单个神经元;双光子成像动物必须头部固定,可记录单个神经元,更可观察到皮层神经元亚细胞结构轴突末端的钙信号;光纤记录无细胞分辨率,记录不同脑区的群体神经元活动(仅限光纤探针尖端附近);微型显微镜(单光子成像),可长时间记录群体神经元,透镜植入会引起组织损伤,某些行为学实验不适用(水迷宫、强迫游泳)。不同的方式各有优劣势,需根据具体的实验条件和需求选择。

图1.钙离子成像光纤记录示意图


钙成像绿色荧光指示工具

     GCaMP蛋白,由cpGFP蛋白、CaM(calmodulin钙调蛋白)、M13肽这三个结构组成,当有钙离子存在时,CaM和M13结合,连带引起cpGFP蛋白的构象,增强荧光信号。在实验中用于指示细胞中的Ca信号活动,又被称为GeCI(genetically encoded calcium indicator)。

GCaMP6 GCaMP6(495 nm).

GCaMP6s slow光强最强,更晚淬灭(低频最敏感)

GCaMP6m medium光强和淬灭中等(中等)

GCaMP6f fast光强较弱,更快淬灭(高频)

     GCaMP6是新一代的GCaMP蛋白,它的钙指示功能达到甚至超过了常用的化学钙指示剂。它有三种常用的亚型,6s,6f和6m,其中对于钙离子的结合力,6s>6m>6f,所以6s最敏感,适合低频信号的指示,6f解离最快,适合高频信号的指示,6m结合活性适中,适用的范围最广。GcaMP6是一种超灵敏的荧光蛋白,可以特异高效地反映细胞内游离Ca2+浓度的变化,在活体下,对单个动作电位诱发的钙信号,GCaMP6比GCaMP3强10倍,动力学快2倍。因此GcaMP6荧光蛋白可以作为一种超敏Ca2+探针,用于研究生理和病理情况下外界因素对活细胞内Ca2+的影响。

100-150 ms,GCaMP6s;75-100 ms,GCaMP6m;50-75 ms,GCaMP6f

参考文献

Chen,T.W.,Wardill,T.J.,Sun,Y.,Pulver,S.R.,Renninger,S.L.,Baohan,A.,Schreiter,E.R.,Kerr,R.A.,Orger,M.B.,Jayaraman,V.,et al.(2013).Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.Nature 499,295-300.


轴突钙成像(Axon-GCaMP6)

     Axon-GCaMP6系统是由常规的GCaMPs蛋白在N端融合一个驱动轴突定位的靶向元件GAP43(growth associated protein-43)组成的轴突钙成像系统。

特点:在树突和远端轴突中也能表达


图2.轴突钙成像(Axon-GCaMP6)

参考文献Broussard,G.J.,Liang,Y.,Fridman,M.,Unger,E.K.,Meng,G.,Xiao,X.,Ji,N.,Petreanu,L.,and Tian,L.(2018).In vivo measurement of afferent activity with axon-specific calcium imaging.Nature neuroscience 21,1272-1280.


无损伤钙离子探针(GCaMP-X)

     钙调素(Calmodulin,CaM)严重干扰了L型电压门控钙通道介导的兴奋-转录耦联,使得神经元的钙动态以及基因表达均出现异常。在探针中引入特异性apoCaM保护元件以克服“非钙结合态钙调素”(apoCaM)的干扰。


图3.胞质定位的GCaMP6m-Xc与GCaMP在细胞内的区别示意图

参考文献

Yang Y, Liu N, He Y, Liu Y, Ge L, Zou L, Song S, Xiong W, Liu X. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nat Commun. 2018 Apr 17;9(1):1504.


实测病毒效果


图4.枢密科技GCaMP6m-Xc 3周和13周活体检测结果图

1、低滴度GCaMP6m-XC表达量相对较低,可能会不利于在体双光子实验,推荐使用者使用10^13高滴度病毒,可有效提高表达量,有利于在体双光子实验。

2、GCaMP-Xc病毒特别适合于需要超长时间尺度(≥4周)观测钙信号的实验,建议在相关宣传中突出此点即可。

要求:高滴度

特点:1不聚集核内;2不影响钙调素相关通通路不损伤神经元;3可以超长时间观测钙信号(≥4周)


二、我司提供钙成像病毒及相关实验外包服务

表1钙成像病毒产品列表




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