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化学遗传学产品(激活及抑制)

化学遗传学调控特定神经元活性——21世纪神经科学研究的利器!

化学遗传学产品

背景

     化学遗传学(Chemical genetics)又称药物遗传学,是通过调查筛选化学小分子库,而对蛋白质功能以及细胞内信号转导通路进行研究的一门学科。该技术是对一些生物大分子实行改造,使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过程,从而达到控制生物大分子活性的作用。

     随着生物和化学交融的更加紧密,通过对生物体原有的配体与受体进行改造,得到了大量的具有外源物质激活、调节细胞通路的人工改造受体。目前改造的受体包括蛋白激酶、核酸杂交、各种代谢酶和G蛋白偶联受体,基于G蛋白偶联受体改造的化学遗传学受体有很多,从1991年构建的等位基因特异激活的基因编码受体(Allele-specific activation of genetically encoded receptors),到1998年构建的只能被合成配体激活的受体(Receptorsactivated solely by synthetic ligands, RASSLs)和基因工程改造的受体(Engineered receptors),再到2007年构建的只由特定药物激活的受体(Designer receptors exclusively activated by designer drugs, DREADDs)(如图6)。现在DREADDs已成为应用最广泛的化学遗传学技术。

图1.化学遗传学改造天然受体得到的人工受体(Bryan L.Roth. Annu.Rev.Neurosci. 2014)


DREADDs技术

     DREADDs技术是指只由特定药物叠氮平-N-氧化物(Clozapine-N-oxide,CNO)激活或抑制DREADDs受体,这些激活或抑制后的受体会选择性地作用于不同的GPCR级联反应来调节细胞信号转导,包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin,其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。

Gq-DREADD(hM3Dq)

     hM3Dq是从人毒蕈碱乙酰胆碱受体M3上改造的仅对CNO(clozapine-N-oxide)有反应的人工受体(DREADD),不再受乙酰胆碱激活。在一些神经元里,CNO结合hM3D后,激活Gq蛋白偶联的磷酸酶PLCβ,引起PIP2被降解,从而使得被PIP2关闭的KCNQ外向钾离子通道被打开,以至于细胞膜去极化,形成动作电位。在KCNQ或是Gq不表达的神经元里,hM3D的功能可能会有所不同。

Gi-DREADD(hM4Di)

     hM4Di是从人毒蕈碱乙酰胆碱受体M4上改造的仅对CNO(clozapine-N-oxide)有反应的人工受体(DREADD),不再受乙酰胆碱激活。在一些神经元里,CNO结合hM4D后,激活Gi蛋白偶联的内向钾离子通道GIRK,使得细胞膜超极化,抑制神经元细胞动作电位发放。 在不表达GIRK或是Gi的细胞中,hM4D的功能会有所不同。


实施方法

     激活或抑制神经元是通过激活或抑制DREADDs受体,而要想达到激活或抑制DREADDs受体的目的,就要选择相应的DREADDs受体。DREADDs的操作步骤如下(如图2):

①选择符合实验目的的DREADDs受体;

②将DREADDs受体基因和特异性启动子导入病毒载体并感染动物机体,使在靶细胞中表达DREADDs受体;

③在合适的时间点给予(立体定位、腹腔注射或喂水)实验动物CNO,激活或抑制DREADDs受体;

④通过行为学或电生理记录神经元活性改变带来的变化。

图2.化学遗传学的实验步骤


应用案例

     化学遗传学技术也被广泛用于神经科学领域,下面介绍几例运用该技术的研究案例:


案例1

     2017年3月,暨南大学任超然实验室在《Nature Communication》发表研究论文,该项工作是借助化学遗传、钙离子成像及神经示踪揭示了视网膜缝投射通路,及视网膜缝神经元对防御行为的调控(如图3)。

图3.视网膜缝神经元对防御行为的调控(Chaoran Ren, et al.,Nature Communication, 2017)


案例2:

     此外,《Neuron》在2019年1月发表了国科学院上海生命科学研究院孙衍刚的工作,该工作借助了化学遗传学来研究外侧/腹外侧中脑导水管周围灰质(l/vlPAG)谷氨酸能神经元在瘙痒中的功能作用。作者通过抑制l/vlPAG谷氨酸能神经元后,观察到组胺或氯喹诱导的瘙痒抓挠行为明显减弱(如图4)

图4.l/vlPAG谷氨酸能神经元在瘙痒中的功能作用


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参考文献

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