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技术与服务

CRISPR/Cas9基因编辑工具载体设计与构建

CRISPR-Cas9基因编辑服务

一、CRISPR-Cas技术是什么?

      CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了获得性免疫:这与哺乳动物的二次免疫类似,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi) 的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能,      CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中,CRISPR/Cas系统拥有多种类别,其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入,应用最成熟的一种类别。

      CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉,操作方便,效率高等优点,CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室,成为了生物科研的有力帮手。


二、CRISPR-Cas9技术原理

      CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeat)与长度相似的间隔序列(spacer)间隔排列组成。Cas基因是一类基因家族,编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性。根据Cas 基因的不同,将CRISPR-Cas9系统分为Ⅰ-Ⅲ 3种类型。在Ⅰ型 与Ⅲ型CRISPR-Cas9系统中,pre-crRNA 初级转录本被CRISPR相关RNA 酶切割成重复序列,释放小的成熟crRNA。成熟crRNA再与相关蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合体指导内切核酸酶对外源DNA 序列的识别与降解。Ⅱ型CRISPR-Cas9系统是目前最常用于人工基因组编辑的CRISPR-Cas9系统。根据Cas蛋白的类型不同分为3个亚类:Ⅱ-A型含有Cas1、Cas2、Cas9 和Csn2蛋白质;Ⅱ-B型含有Cas1、Cas2、Cas4 和Csx12 样Cas9 4种蛋白质;Ⅱ-C型则有Cas1、Cas2 及Cas93种蛋白质。其中,Ⅱ 型CRISPR-Cas9 系统最早在改造后用于小鼠和灵长类基因组编辑,是目前研究最为充分的系统。它只需要单独的Cas9蛋白即可在gRNA(guide RNA)的引导下完成对DNA的定点切割。Cas9 蛋白行使功能需CRISPR转录而来的crRNA 与反式激活的及与CRISPR重复区互补的tracrRNA(trans-activiting crRNA,tracrRNA)形成的复合物参与。为了操作简便,研究者将crRNA和tracrRNA 融合进同一条单链中,设计出单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)。在sgRNA的指导下,Cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。对靶序列有效的切割还需靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序,即PAM(protospacer-associated motif)的参与。PAM提供两个冗余的检查点,确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理为将tracrRNA:crRNA设计为sgRNA,sgRNA包含位于5′端的靶DNA的互补序列,以及位于3′端的tracrRNA:crRNA的类似序列,crRNA 或sgRNA包含一个20nt指导序列可以直接匹配的靶位点,利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点,利用tracrRNA:crRNA的类似序列与Cas9结合,实现目标基因定向基因组改造。

图1. CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理


三、CRISPR-Cas9应用


四、CRISPR-Cas9技术优势

1. 效率高:可精确编辑基因组,编辑效率高;

2. 周期短:构建和使用极为方便,极大降低了实验难度,缩短实验周期;

3. 广谱性:无基因、细胞及物种限制;

4. 多重编辑能力:可实现多个靶位点同时进行基因打靶;

5. 功能丰富:可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因.


五、CRISPR-Cas9基因编辑服务步骤

1.  靶基因分析;

2.  sgRNA位点设计与筛选;

3.  载体构建;

4.转染目标细胞系;

5.  qPCR方法检测载体活性;

6.病毒包装.


六、服务项目周期

编号

项目内容

周期(周)

注:周期为工作日

1

sgRNA的设计与构建

(设计8条sgRNA序列)

1

2

sgRNA的筛选

2

3

载体构建

注:sgRNA串联几个待定,需要等筛选结果


3

4

转染目标细胞系,qPCR方法检测载体活性

1

5

病毒包装

3

交付内容:一个病毒和两个筛选报告

合计:10



CRISPR-dCas9转录激活服务


概述

      CRISPR/Cas9系统是一种由RNA引导Cas9蛋白对靶基因进行修饰的技术。将Cas9中切割域突变,就会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性,但不影响其与DNA的结合能力,这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白被命名为 Dead Cas9(dCas9) 。利用gRNA介导dCas9能够精确识别靶基因的特点,将dCas9蛋白与具有转录激活功能的蛋白结构域融合,可构建具有转录激活活性的系统,简称CRISPRa。

      与传统转基因相比,CRISPRa系统是通过激活细胞内源基因表达来提高目标基因的表达量,它不需要转入外源DNA,降低了由于转基因造成的基因组不可逆转突变的风险。另外结合gRNA文库,可同时激活多个基因的转录与表达。此前Gain-Of-Function筛选主要是通过cDNA文库实现,但由于部分cDNA克隆难度较大致使cDNA文库覆盖率不完全;同时cDNA文库并不能涵盖每个基因的所有转录本;基因的表达也会受到细胞内部元件的调控。利用dCas9-VP64-gRNA系统进行的高通量筛选可在同一个启动子上设计多个gRNA来提高基因的转录活性,基因转录本也会更为全面。已有研究表明,利用CRISPR/Cas9系统选择性的上调基因表达,可以用来诱导干细胞的分化或重编程、刺激组织再生、补偿遗传缺陷、激活已经失活的抑癌基因、进行基因功能筛选以及合成基因回路。


技术原理

      CRISPR/Cas9系统转录激活原理:dCas9与转录活化域VP64/VPR融合,表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区,并通过VP64/VPR激活区域与PolII结合,激活基因的转录。


解决方案

      枢密科技可实现单个或多个基因的转录激活,也可以通过gRNA文库,实现全基因组的转录激活调控,用于基因功能的研究及靶基因的筛选。


服务流程

gRNA设计 与筛选,转录激活载体构建,QPCR验证激活效率,病毒包装,稳定细胞系构建。


实验方案及报价

方案一:Crispr/dSaCas9转录激活系统-AAV

编号

项目内容

操作方法

报价(元)

周期(周)

1

sasgRNA的设计与构建

设计8条sasgRNA序列,位置ATG上游0-400bp


AAV-U6-sasgRNA-CMV-SV40-NLS-saCas9-NLS-Flag -WPRE


8*900=7200

1

2

sasgRNA的筛选


在B16细胞上进行筛选,最终选出有效序列2-4条


4000

2

3

转录激活载体构建

注:sgRNA串联几个待定,需要等筛选结果


AAV-CMV-NLS-dSaCas9-NLS-V64-U6-sgRNA


2*1580=3160

3

4

qPCR方法转录激活验证

质粒转染,收细胞,内参GAPDH

4000

1

5

病毒包装

病毒包装,纯化,滴度检测

10280(1.00E+12vg)

3

合计  注:周期为工作日

31740

10

交付内容:一个病毒和两个筛选报告


方案二:Crispr/dSaCas9转录激活系统-Lentivirus

编号

项目内容

操作方法

报价(元)

周期(周)

1

sasgRNA的设计与构建

设计8条sasgRNA序列,位置ATG上游0-400bp


LV-U6-sasgRNA-CMV-SV40 NLS-saCas9-NLS-Flag-P2A-Puro-T2A-EGFP-WPRE


8*900=7200

1

2

sasgRNA的筛选


在B16细胞上进行筛选,最终选出有效序列2-4条


4000

2

3

转录激活载体构建

注:sgRNA串联几个待定,需要等筛选结果


LV-CMV-NLS-dSaCas9-NLS-VPR-U6-sgRNA


2*1580=3160

3

4

qPCR方法转录激活验证

质粒转染,收细胞,内参GAPDH

4000

1

5

病毒包装

病毒包装,纯化,滴度检测

5600(1.00E+08TU)

3

合计  注:周期为工作日

23960

10

交付内容:一个病毒和两个筛选报告

注意:方案一中AAV(腺相关病毒载体)的载量为4.7kb,因此质粒中转录激活结构域选择片段大小为150bp的VP64;方案二中LV(慢病毒载体)的载量为6kb,因此质粒中转录激活结构域选择片段大小为1569bp的VPR(VP64, p65, and Rta );但是相关文献显示VP64对蛋白过表达的效果不佳,因此可按照需求选择其中一种病毒载体进行后期实验操作。


靶向RNA的CRISPR/Cas13d系统

简介

      CRISPR/Cas系统是目前被广泛的运用的基因编辑系统,其中,最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统,而CRISPR/Cas13d是目前最新的VI-D类靶向RNA的CRISPR/Cas系统。Cas13d蛋白与之前发现的Cas13a/b/c相比蛋白更小,这种尺寸使其更容易包装到容量较小腺相关病毒(AAV)载体中。

      通过设计sgRNA(short guide RNA),以引导CasRX(Cas13d的一种)蛋白在对RNA的定点切割,造成RNA的降解,达到抑制基因表达的目的。由于CRISPR/Cas13d系统不借助细胞体内的RISC(RNA介导的沉默复合物,shRNA干扰的核心结构),使其不仅能高效干扰细胞质RNA,而且能高效的干扰核内RNA(lncRNA等),补充了shRNA在核内RNA干扰上的不足。

      通过突变CasRx,得到失去了催化活性但保留了RNA结合活性的dCasRx,可用于介导mRNA选择性剪接。


应用

CRISPR/Cas13d:lncRNA(long non-coding RNA)、Pre-mRNA、mRNA等细胞质和细胞核内RNA的高效和高特异性干扰。


技术优势

1 CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA特异性更强,脱靶率极低;


2 CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA干扰效果更好并且稳定性更高,适应范围更广;


3 CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA一个载体能同时干扰多个基因;


4 CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA不仅可以干扰细胞质RNA,还可以干扰核内RNA;


5无PAM序列限制的sgRNA,拥有更多的可选择靶向位点


服务内容

1 CRISPR/Cas13d干扰载体构建服务


2 CRISPR/Cas13d干扰腺相关病毒(AAV)包装服务


3 CRISPR/Cas13d干扰慢病毒包装以及干扰稳转细胞系的构建服务



服务流程


客户提供

1干扰的目的基因模板(质粒/菌液)或基因序列(序列/ID)以及物种来源

2病毒类型选择以及要求

3血清型选择


案例展示

1 Salk生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)的Konermann等人研究发现,CasRx在哺乳动物细胞中能够很好地发挥功能。同时还将CasRx与shRNA干扰、dCas9介导的转录抑制(CRISPRi)敲低进行比较。结果发现,CasRx是对编码和非编码的RNA抑制效果最明显,其敲低效率为96%,shRNA干扰为65%,而CRISPRi为53%。此外,与shRNA干扰相比,CasRx也表现出对RNA干扰具有极高的特异性,为零脱靶,而shRNA处理产生500-900个明显的脱靶。

2 CasRx介导特异和高效干扰多种人类编码和非编码RNA(Konermann et al., 2018, modified)


2 Konermann等人测试了dCasRx通过外显子跳跃操控RNA剪接的能力。以编码痴呆相关tau蛋白的MAPT基因为研究对象,导入dCasRx实现MAPT选择性剪接。通过AAV载体导入iPS衍生的皮质神经元之后,dCasRx(无催化活性,但保留了RNA结合活性)介导的外显子跳跃明显地调整了致病性与非致病性tau的比例,展示了dCasRx拥有非常好的临床应用前景。

3 AAV病毒传递dCasRX进行选择性剪接(Konermann et al., 2018, modified)


参考文献

1. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N.J., Oki, J., Shokhirev, M.N., and Hsu, P.D. (2018). Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR effectors. Cell 173, 665-676 e614.

2. Yan, W.X., Chong, S., Zhang, H., Makarova, K.S., Koonin, E.V., Cheng, D.R., and Scott, D.A. (2018). Cas13d is a compact RNA-targeting type VI CRISPR effector positively modulated by a WYL-domain-containing accessory protein. Molecular cell 70, 327-339 e325.








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