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产品及应用

钙成像病毒产品

钙成像病毒产品

简介

     钙成像技术(calcium imaging)是指利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的方法。在神经系统研究方面,在活体(in vivo)或者离体(in vitro)研究中,钙成像技术被广泛应用于同时监测成百上千个神经元内钙离子的变化,从而检测神经元的活动情况。有了钙成像技术,原本悄无声息的神经活动就变成了一幅斑斓闪烁的壮观影像,科学家终于可以亲眼看着神经信号在神经网络之中往来穿梭。因此,这种技术一出现,就受到了全世界神经科学家们的追捧,至今依然是人们观测神经活动最为直接的手段。


基本原理

     在生物有机体内,钙离子产生各种各样的胞内信号,这些胞内信号几乎在每种类型的细胞中都存在,在很多功能方面有重要作用,例如心脏肌细胞收缩的控制和从细胞增殖到细胞死亡整个细胞周期的调节等。在哺乳动物的神经系统中,钙离子是一类重要的神经元胞内信号分子。在静息状态下,大部分神经元的胞内钙离子浓度为50-100nM,而当神经元活动的时候,胞内钙离子浓度能上升10-100倍,增加的钙离子对于含有神经递质的突触囊泡的胞吐释放过程必不可少。也就是说神经元的活动与其内部的钙离子浓度密切相关,神经元在放电的时候会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰。神经元钙成像技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系,利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针(钙离子指示剂,calcium indicator),将神经元中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来,从而达到监测神经元活动的目的。


钙离子指示剂

     现在广泛使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂(chemical calcium indicators)和基因编码钙离子指示剂(genetically encoded calcium indicators,GECI)两类:

1.化学性钙离子指示剂:指的是可以螯合钙离子的小分子,所有这些小分子都基于EGTA(乙二醇双四乙酸)的同系物BAPTA(氨基苯乙烷四乙酸),BAPTA能够特异地和钙离子螯合,而不会和镁离子螯合,所以被广泛地用作钙离子螯合剂。现在使用较广泛的化学性钙离子指示剂有:Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。

2.基因编码钙离子指示剂:这些指示剂是来自于绿色荧光蛋白(GFP)及其变异体(例如循环排列GFP,YFP,CFP)的荧光蛋白质,与钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶M13域融合。现在使用较广泛的基因编码钙离子指示剂有:GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch,其中GCaMP6由于它有着超强的敏感度,现在被广泛应用于活体钙成像研究。


钙成像技术在神经科学研究中的应用举例

     不论采用哪一类钙离子指示剂,成像记录过程都是非常类似的。包含钙离子指示剂的细胞可以通过荧光显微镜(fluorescence microscope)观测,然后通过CCD摄像机捕捉、记录。现在钙成像技术主要在以下几类神经科学研究方面有广泛应用:

1.记录培养的神经元的活动;

2.记录脑片上神经元的活动;

3.活体记录神经元的活动;由于离体实验本身的限制,现在越来越多的神经科学家倾向于做活体钙成像实验,希望能得到更准确且更能反应生理状况的数据。得益于双光子荧光显微镜的发展,现在,在实验动物处于活体状态下进行钙成像记录的技术取得了飞速进展。

4.活体记录神经元树突和树突棘(spine)的活动由于对实验精度的要求,有些科学家不仅仅想记录单个神经元的反应,他们还想更精确地知道神经元上哪些树突和树突棘参与了某个行为,也就是说他们需要在活体条件下,对单根树突以及树突上spine进行钙成像记录实验。由于双光子荧光显微镜和GCaMP6基因编码钙离子指示剂的发展,现在,对树突和树突棘用钙成像实验进行记录也成为了可能。


实施方法

Step1:选择合适的钙离子指示剂。

Step2:将钙离子指示剂转运至目标部位。

     化学荧光指示剂通常采用电极刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式进入到目标部位,而GECI指示剂则主要借助于病毒感染的方式导入至目标部位。

Step3:收集信号,记录结果。

     钙离子荧光信号的检测一般有多种选择,如多通道在体电生理,可记录多脑区,并精确到单个神经元;双光子成像动物必须头部固定,可记录单个神经元,更可观察到皮层神经元亚细胞结构轴突末端的钙信号;光纤记录无细胞分辨率,记录不同脑区的群体神经元活动(仅限光纤探针尖端附近);微型显微镜(单光子成像),可长时间记录群体神经元,透镜植入会引起组织损伤,某些行为学实验不适用(水迷宫、强迫游泳)。不同的方式各有优劣势,需根据具体的实验条件和需求选择。


图1.钙离子成像光纤记录示意图



2.GCaMP蛋白的基本结构和原理(Ali Gheisari.2017.


钙成像绿色荧光指示工具

     GCaMP蛋白,由cpGFP蛋白、CaMcalmodulin钙调蛋白)、M13肽这三个结构组成,当有钙离子存在时,CaMM13结合,连带引起cpGFP蛋白的构象,增强荧光信号。在实验中用于指示细胞中的Ca信号活动

GCaMP6 GCaMP6(495 nm)

GCaMP6s slow光强最强,更晚淬灭(低频最敏感)

GCaMP6m medium光强和淬灭中等(中等)

GCaMP6f fast光强较弱,更快淬灭(高频)

     GCaMP6是新一代的GCaMP蛋白,它的钙指示功能达到甚至超过了常用的化学钙指示剂。它有三种常用的亚型,6s6f6m,其中对于钙离子的结合力,6s>6m>6f,所以6s最敏感,适合低频信号的指示,6f解离最快,适合高频信号的指示,6m结合活性适中,适用的范围最广。GCaMP6是一种超灵敏的荧光蛋白,可以特异高效地反映细胞内游离Ca2+浓度的变化GCaMP6荧光蛋白可以作为一种超敏Ca2+探针,用于研究生理和病理情况下外界因素对活细胞内Ca2+的影响。

100-150 ms,GCaMP6s75-100 ms,GCaMP6m;50-75 ms,GCaMP6f

参考文献

Chen,T.W.,Wardill,T.J.,Sun,Y.,Pulver,S.R.,Renninger,S.L.,Baohan,A.,Schreiter,E.R.,Kerr,R.A.,Orger,M.B.,Jayaraman,V.,et al.(2013).Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.Nature 499,295-300.


轴突钙成像(Axon-GCaMP6

     Axon-GCaMP6系统是由常规的GCaMPs蛋白在N端融合一个驱动轴突定位的靶向元件GAP43growth associated protein-43)组成的轴突钙成像系统。

特点:在树突和远端轴突中也能表达

3.轴突钙成像(Axon-GCaMP6)

Yang Y et al.,Nature communications,2018

参考文献

Broussard,G.J.,Liang,Y.,Fridman,M.,Unger,E.K.,Meng,G.,Xiao,X.,Ji,N.,Petreanu,L.,and Tian,L.(2018).In vivo measurement of afferent activity with axon-specific calcium imaging.Nature neuroscience 21,1272-1280.


无损伤钙离子探针(GCaMP-X

     钙调素(CalmodulinCaM)严重干扰了L型电压门控钙通道介导的兴奋-转录耦联,使得神经元的钙动态以及基因表达均出现异常。在探针中引入特异性apoCaM保护元件以克服非钙结合态钙调素apoCaM)的干扰。


4.胞质定位的GCaMP6m-XcGCaMP在细胞内的区别示意图

Yang Y et al.,Nature communications,2018


成像技术应用案例

1GCaMP6f

     客户发表文章:Science.(IF=47.728).Ren S,et.al.(2018).The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness.[腺相关病毒,觉醒]

注射部位:小鼠PVT

载体:AAV-CaMKIIα-GCaMP6f

注射体积:100nl

观察时间:4


2GCaMP6s

     ①客户发表文章:Science.(IF=47.728).Mu D,et.al.(2017).A central neural circuit for itch sensation.[腺相关病毒,,光遗传,化学遗传,钙成像]

注射部位:小鼠PBN

载体:AAV-hSyn-GCaMP6s

血清型rAAV2/9

病毒滴度5.3E+12 VG/mL

注射体积300nl

观察时间3


     ②客户发表文章Nature Neuroscience.(IF=24.884).Yao J,et.al.(2018).A corticopontine circuit for initiation of urination.[腺相关病毒,神经环路,排尿]

注射部位:小鼠皮层M1PMC

载体rAAV2/1-hSyn-Cre、rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherryrAAV2/9-DIO-GCaMP6s

病毒滴度rAAV2/1:5E+12 VG/mLrAAV2/9-DIO-hChR21.2E+13VG/mLrAAV2/9-DIO-GCaMP6s0.5E+12 VG/mL

注射体积:多点注射,每位点30-40nl

观察时间4


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