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技术与服务

AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰

AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰

一、原理及应用介绍

     circRNAs(CircularRNAs,环形RNA分子)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子,通过非经典剪接方式进行反向剪接而形成。circRNA由特殊可变剪切产生,大量存在于真核细胞的细胞质中,主要来源于外显子,少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中,表达水平具有种属、组织、时间特异性。circRNA呈闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,比线性RNA更加稳定,具有一定序列保守性,在转录或转录后水平发挥调控作用。绝大多数circRNA是非编码的,但也有少数可以翻译为多肽。

     circRNA的作用机制有:1、作为miRNA分子的海绵(主要的),circRNA含有大量的miRNA结合位点,具有miRNA海绵作用,进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。2、作为蛋白分子的海绵,有些环状RNA上有一个或者多个RNA结合蛋白的结合位点,可作为蛋白分子的海绵体。3、引起免疫响应,有些内源性环状RNA在抗病毒反应中发挥作用,而有些环状RNA与免疫响应相关,外源性环状RNA可以通过激活模式识别受体RIG-I刺激哺乳动物细胞的免疫信号。4、编码功能,circRNA虽然属于非编码RNA,但是也有少数circRNA可以编码多肽,通过编码多肽行使调控功能。

图1.circRNA的生物发生(Kristensen LS,et al.Nat Rev Genet.2019.)


AAV介导circRNA过表达应用实例Meganck RM, et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2021.

     C57BL/6小鼠尾静脉注射(3×1011vg/每只)AAV9-CMV-HIPK3 Polio(HIPK3内含子+脊髓灰质炎病毒IRES+GFP外显子)及AAV9-CMV-HIPK3 Polio△△(L△R△内含子+脊髓灰质炎病毒IRES+GFP外显子),4周后取材切片观察,结果显示均可在心脏、肝脏及肌肉中过表达,且L△R△内含子对的circRNA表达效果更好。

图2. L△R△内含子对可增加小鼠体内多个组织中的circRNA表达


二、我司提供AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰服务

      我司提供pAAV-ciR、pLV-ciR等circRNA过表达载体构建服务,同时可选择携带各种荧光报告基因或抗性基因,适用于普通真核表达、慢病毒包装与稳转细胞系建立、腺相关病毒包装等多种用途。该系列载体均含有circRNA环化表达框架,用于克隆目标circRNA的线性序列,之后转染细胞后可通过RNA剪切形成circRNA分子。

     我司针对circRNA的接头序列设计多条siRNA序列,筛选特异性高效干扰目的circRNA表达的siRNA,构建shRNA病毒载体并包装所需病毒。也可直接转染或通过包装慢病毒感染细胞筛选circRNA特异性敲低稳定细胞株。


过表达服务流程

1、客户提交circRNA资料(ID号或者序列)、构建要求;

2、circRNA过表达载体构建;

3、载体验证(根据客户选择,默认提供293细胞转染验证环化效果);

4、病毒包装;

5、稳定细胞株构建(根据客户需要选择,需要客户提供目标细胞)。


需客户提供内容/材料

1:过表达的目的基因模板(质粒/菌液)或基因序列(基因ID);

2:病毒类型选择以及要求;

3:血清型选择。


最终交付

1:载体构建报告;

2:合同约定的rAAV/慢病毒的滴度和病毒量;

3:质检报告;

4:测序文件;

5:过表达质粒/病毒/稳定细胞系。


RNA干扰服务流程

1、客户提交circRNA资料(ID号或者序列)、构建要求;

2、设计多条siRNA,筛选高效率干扰siRNA;

3、设计circRNA特异性引物,检测敲低circRNA的效率;

4、构建shRNA载体,干扰慢病毒或腺相关病毒包装;

5、稳定细胞株构建(可选,需要客户提供目标细胞)。

:过表达筛选保证3条里面有1条干扰效率达到70%以上。


表1.服务内容及周期




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