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神经递质探针类、钙离子探针类神经干细胞

神经递质探针类、钙离子探针类神经干细胞

一、神经干细胞原理及应用

     神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)是能够自我更新,并且具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多项分化潜能的细胞。发育过程中,NSCs存在于神经管,随后逐渐进入室管膜下区、纹状体和海马中。科学界曾认为,只有胚胎发育阶段才会产生新的神经元。后来大量研究表明,成年哺乳动物脑中也存在NSCs,主要分布于海马齿状回下层颗粒(subgranular zone,SGZ)和侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)。在整个生命周期中,不断有新的神经元产生;大脑受到损伤时,一些休眠的NSCs将被激活。

     NSCs可修复受损的神经系统,移植的NSCs又趋向于定植病灶部位,在神经系统再生治疗领域拥有广阔的前景。然而NSCs数量极少,取材又极其困难,从胚胎干细胞诱导分化获取NSCs又受到伦理限制。好在随着重编程技术的发展,现已实现从成体细胞直接重编程为NSCs,或从诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)分化得到大量NSCs,使得NSCs移植能够真正进入临床应用。

图1.神经干细胞特性。神经干细胞能够分泌神经营养因子、生长因子和细胞因子来保护神经系统;神经干细胞分化为神经元或胶质细胞前体细胞,再分化为神经元或胶质细胞来代替神经系统中丢失的细胞,在神经损伤修复中起到重要作用。(图片改自Tang Y,et al.,Cell Death Dis.2017.)


神经干细胞应用

细胞治疗

     神经干细胞研究在神经退行性疾病、脊髓损伤、脑卒中、脑瘫、癫痫、外伤性脑损伤等多种神经疾病中取得了重大进展。有许多研究报道,NSCs移植到脑梗死、脊髓损伤、阿尔茨海默病等神经疾病动物模型,在损伤处分化形成新的神经元或胶质细胞,分泌多种营养因子,有效改善病情且未发现肿瘤形成。


基因治疗载体

     神经干细胞拥有定植于疾病或损伤区的能力,这种“亲病灶性”使得NSCs可以作为基因和药物治疗的载体。对NSCs进行基因修饰,使其分泌特定的因子,并输送到损伤部位。有研究发现,基因工程修饰的NSCs移植后可以分泌药物前体激活胞嘧啶脱氨酶活化酶,缩小裸鼠髓母细胞瘤的瘤块。


药物研发及其他科研应用

     药物研发领域,神经干细胞(或分化后神经元/胶质细胞)可作为药物筛选、药效验证、毒性测试的细胞模型;在基础研究领域,由各种基因修饰神经干细胞构成的工具细胞库,是体内、体外研究神经干细胞治疗分子/细胞/神经环路机制和生理过程的前沿技术和系统工具。

图2.神经干细胞应用


二、产品介绍

     枢密研发的基因修饰神经干细胞系,是通过基因工程技术,对神经干细胞进行遗传修饰,使其稳定表达特定的外源基因,如荧光蛋白、神经递质探针、钙离子探针、光敏感蛋白等,实现对细胞进行实时观察与精确操纵,应用于电生理、光遗传学、神经回路示踪等多种领域。同时,枢密可提供神经干细胞定向分化培养基,可将神经干细胞分化为感兴趣的神经细胞类型,为客户提供更加便捷的实验条件,提高实验的可重复性。

图3.基因修饰神经干细胞产品应用


神经递质探针类神经干细胞

     大脑复杂功能的实现离不开神经元之间高效特异的信息交流和整合,神经递质作为重要的生物小分子,参与了神经元间化学突触介导的信息传递过程。

     传统的直接测量法无法实现单个细胞水平的递质检测,且特异性不够高,时间和空间精度也较差。新型探针GRAB(GPCR Activation Based Sensor)可以实时精确地检测神经递质的动态变化,灵敏度高,特异性高,分辨率高,用于在高时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能。

图4.GRAB探针原理示意图。将循环重排荧光蛋白插入到G蛋白偶联受体(GPCR)与配体(神经递质)结合后构象改变最显著的区域,形成融合蛋白。一旦特定的神经递质激活GPCR使其构象改变,与之相连的荧光蛋白的构象也发生改变,荧光强度发生变化,从而指示神经递质浓度的动态变化。(图片修改自Jing M,et al.,Nat.Biotechnol.2018)


图5.表达乙酰胆碱探针(GACh2.0)的皮质神经元。实验组在浴液中加入100μM乙酰胆碱(ACh),共聚焦显微镜记录绿色荧光变化。(图片修改自Jing M,et al.,Nat.Biotechnol.2018)


神经递质探针类神经干细胞产品


钙离子探针类神经干细胞

     利用可以感应Ca2+浓度的指示剂,将钙浓度变化转化为荧光信号。钙离子指示剂分为两种,一种为化学指示剂,另一种为现在普遍使用的遗传编码指示剂,例如GCaMP,其原理如下图所示(图6)。

     钙离子成像技术广泛应用于神经生物学,细胞生物学,生理学,发育生物学和药物学领域中。其中,神经生物学中主要研究神经细胞离子浓度改变引发的信号发射,通过记录被GFP标记到的神经细胞发光的有无和强弱判断神经细胞活动。

图6.GCaMP探针原理示意图。GCaMP由循环重排绿色荧光蛋白(cpGFP)、钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当Ca2+结合CaM时,CaM构象改变,其铰链区结合M13,使cpGFP在特定波长的光照下其发色团质子化作用增强,吸光度增加而发出强烈荧光。(图片修改自Lindenburg L,Merkx M.Sensors (Basel).2014.)


图7.表达钙离子探针的海马神经元。激活指示剂后300s,荧光信号充满了整个细胞,包括树突和树突棘。(图片引自Berlin S,et al.,Nat Methods.2015.)


钙离子探针类神经干细胞产品


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