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CRISPR-Cas13d RNA编辑

CRISPR-Cas13d RNA编辑

一、原理及应用介绍

     2017年Feng Zhang实验室发现切割RNA的Cas13a(之前称作C2c2),能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA和报告RNA水平。CRISPR/Cas13d是目前最新的VI-D类靶向RNA的CRISPR/Cas系统。Cas13d蛋白与之前发现的Cas13a/b/c相比蛋白更小,这种尺寸使其更容易包装到容量较小腺相关病毒(AAV)载体中。

     CasRx(Cas13d的一种)蛋白能够通过sgRNA引导在哺乳动物细胞内对RNA定点切割,造成RNA降解,达到抑制基因表达的目的。CRISPR/Cas13d系统不借助细胞体内的RISC(RNA介导的沉默复合物),使其不仅能高效干扰细胞质RNA,而且能高效的干扰核内RNA(lncRNA等),弥补了了shRNA在核内RNA干扰上的不足。通过突变CasRx,得到失去了催化活性但保留了RNA结合活性的dCasRx,可用于介导mRNA选择性剪接。

 

图1.靶向RNA的CRISPR/CasRx系统(Konermann S,et al.Cell,2018)

 

应用领域

CRISPR/Cas13d:lncRNA(long non-coding RNA)、Pre-mRNA、mRNA等细胞质和细胞核内RNA的高效和高特异性干扰。

CRISPR/dCas13d:dCasRx介导pre-mRNA选择性剪接,改变不同转录本所占比例。

 

测试数据展示

     根据目的基因ANXA4(mRNA annexin A4),MALAT1(Long Non-Coding RNA Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1)序列设计靶标gRNA,构建CRISPR/CasRx(CasRx-gRNA)系统载体,转染293T细胞进行Q-PCR检测。

 

 

图2.qPCR结果。ANXA4-2(CasRx-gRNA2)能够干扰ANXA4 mRNA的表达,MALAT1-1(CasRx-gRNA1)、MALAT1-2(CasRx-gRNA2)能够干扰MALAT1 lncRNA的表达。


二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务

 

 

 

 

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