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技术与服务

CRISPR-dCas9基因表达调控

CRISPR-dCas9基因表达调控

一、原理及应用介绍

     CRISPR/Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时,Cas9将不具有核酸酶活性,成为dCas9(dead Cas9)。CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子(如VP64、VPR、SAM或SunTag)或转录抑制因子(如KRAB)融合后,结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。


图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因的转录激活与抑制(Gilbert LA,et al.,Cell,2013)


应用领域

CRISPR-dCas9转录激活:可实现目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC、激活沉默基因、遗传缺陷补偿等;

CRISPR-dCas9转录抑制:可实现抑制目的基因表达、分析代谢途径、敲低特定基因转录量以研究基因功能、可与CRISPR/Cas9 Gene Knockout或RNAi技术联合作用等。


应用案例

1.基因敲低(CRISPRi)和基因敲除(CRISPRn)效率的比较

     Mandegar等人通过比较Tet-on调控dCas9-KRAB的基因敲低(CRISPRi)与Tet-on调控Cas9的基因敲除(CRISPRn),发现CRISPRi对NANOG的抑制效果更快且更完全。主要是由于CRISPRn的敲除存在很大的效率问题,在iPS细胞系中NANOG受抑制的仅60%–70%的细胞,而CRISPRi能达到99%以上。


图2. 基因敲低(CRISPRi)和基因敲除(CRISPRn)效率的比较(Mandegar MA,et al.,cell stem cell,2016,modified)


2.dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达

     Chavez等人将dCas9与三种激活因子VP64-P65-Rta(VPR,VP64:疱疹病毒转录因子,P65:NFкB信号通路的成员,Rta:EB病毒激活因子)融合,通过特异性靶向目的基因的sgRNA能特异性的提高内源性基因(MIAT, NEUROD1, ASCL1和RHOXF2)的转录水平,起到激活基因的目的。与dCas9-VP64相比效果更加显著。



图3. dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达(Chavez A,et al.,Nature methods,2015)


二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务

服务内容

1. sgRNA的设计;

2. 细胞内sgRNA剪切活性检测;

3. 依据不同需求选择不同载体的构建:

     a、CRISPR-dCas9转录激活载体的构建:sgRNA-dCas9-VP64/VPR表达质粒

     b、CRISPR-dCas9转录抑制载体的构建:sgRNA-dCas9-KRAB表达质粒

4. 依据所要编辑的细胞选择不同导入方式:

     a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统

     b、脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染

5. RT-PCR检测目的基因的转录水平。


服务流程




需客户提供内容/材料

1、目的基因序列(基因ID)以及物种来源;

2、需介导转录激活或抑制的细胞(可选);

3、病毒类型选择以及要求;

4、血清型选择。


表1.服务信息及最终交付内容、产品



声明:枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究,仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究;禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究;禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定,本公司不承担任何法律责任。


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