CRISPR/Cas9系统中sgRNA识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂，通过细胞内的同源重组（Homologous Recombination,HR）修复方式，将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中，从而实现基因敲入。

图1.CRISPR/Cas9基因敲入示意图（Eric Murillo-Rodríguez,et al.,Sleep and Vigilance,2018）

利用CRISPR/Cas9基因敲入构建KI小鼠

图2.利用CRISPR/Cas9同源重组构建基因敲入小鼠。

向受精卵注射Cas核酸酶、sgRNA以及含有敲入片段的供体，筛选经过同源重组敲入成功的胚胎干细胞，植入代孕鼠体内发育成完整个体（Yang H,et al.Cell.2013）。

图3.通过同源重组在Nanog基因第4个外显子末端插入报告基因荧光蛋白Cherry（A）。

Southern显示重组成功。Nanog基因只在胚胎干细胞表达，干细胞分化后nanog基因不再表达，表现为干细胞表达荧光蛋白Cherry，分化后的细胞无荧光（Yang H,et al.Cell.2013）。

服务内容

1、sgRNA的设计；

2、细胞内sgRNA剪切活性筛选；

3、敲入载体的构建:Cas9-sgRNA表达质粒、donor质粒;

4、依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式:

a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统(Cas9、sgRNA和donor)；

b、脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染(Cas9、sgRNA和donor)；

5、筛选基因敲入单克隆细胞系。

服务流程

需客户提供内容/材料

1.目的基因序列（ID）以及物种来源；

2.靶细胞系及细胞培养条件（可选）；

3.病毒类型选择以及要求；

4.血清型选择。

表1.服务信息及最终交付内容、产品