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技术与服务

CRISPR-Cas9基因敲入

CRISPR-Cas9基因敲入

一、原理及应用介绍

     CRISPR/Cas9系统中sgRNA识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂,通过细胞内的同源重组(Homologous Recombination,HR)修复方式,将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中,从而实现基因敲入。


图1.CRISPR/Cas9基因敲入示意图(Eric Murillo-Rodríguez,et al.,Sleep and Vigilance,2018)


应用实例

利用CRISPR/Cas9基因敲入构建KI小鼠


图2.利用CRISPR/Cas9同源重组构建基因敲入小鼠。向受精卵注射Cas核酸酶、sgRNA以及含有敲入片段的供体,筛选经过同源重组敲入成功的胚胎干细胞,植入代孕鼠体内发育成完整个体(Yang H,et al.Cell.2013)


图3.通过同源重组在Nanog基因第4个外显子末端插入报告基因荧光蛋白Cherry(A)。Southern显示重组成功。Nanog基因只在胚胎干细胞表达,干细胞分化后nanog基因不再表达,表现为干细胞表达荧光蛋白Cherry,分化后的细胞无荧光(Yang H,et al.Cell.2013)。


二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务

服务内容

1、sgRNA的设计;

2、细胞内sgRNA剪切活性筛选;

3、敲入载体的构建:Cas9-sgRNA表达质粒、donor质粒;

4、依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式:

a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统(Cas9、sgRNA和donor);

b、脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染(Cas9、sgRNA和donor);

5、筛选基因敲入单克隆细胞系。


服务流程


需客户提供内容/材料

1.目的基因序列(ID)以及物种来源;

2.靶细胞系及细胞培养条件(可选);

3.病毒类型选择以及要求;

4.血清型选择。


表1.服务信息及最终交付内容、产品



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