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水泡性口炎病毒


背景:水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV) 属于弹状病毒科(Rhabdoviridae) 水疱病 毒属(Vesiculovirus) ,是有囊膜的单股负链RNA 病毒。野生型VSV 具有顺向跨突触传播的特性,能感 染多种动物和昆虫,可以用于灵长类及啮齿类动物神经解剖学的研究。基于这类病毒对人及动物的低危 害性,已经被广泛用于疫苗和基因载体的开发。VSV 作为嗜神经工具病毒,感染神经元后,在极短时间 内高丰度地表达目的蛋白。感染细胞后,其第一批子代病毒最快只需1.5 h 即可被释放出来。van den Pol 等通过构建囊膜糖蛋白缺失且携带GFP 报告基因的dG-VSV ,在病毒感染细胞1 h 之后即可检测到报告 基因的表达。Beier 等测试了VSV 对啮齿类大脑的感染特性,发现其具有顺行跨突触能力,同时也具有 神经元感染的高度特异性,可被其他病毒的囊膜糖蛋白包装而获得不同方向的跨突触能力。他们发现VSV 利用其本身的囊膜糖蛋白(VSV-G) 包装可顺向跨突触感染神经环路;同时,用RV 的囊膜糖蛋白RV-G 替 换VSV 的囊膜糖蛋白VSV-G 之后,病毒可获得逆向跨突触感染神经环路的特性。2013 年,Beier 等又 对VSV 进行了一系列的改造工作,利用类似RV 跨单突触系统的设计方法,实现了基于VSV 对特定神经 网络进行跨单级和跨多级的顺向和逆向标记。


原 理: VSV的囊膜糖蛋白(glycoprotein,G)是其顺向跨突触所必需的蛋白, G蛋白缺失的VSV(VSV- ΔG)会丧失跨突触能力,而其基因组的复制及转录不受影响(可继续高丰度表达外源基因),通过在被 VSV-ΔG 感染的神经元中外源补偿VSV G 蛋白,VSV-ΔG 可重获顺行跨突触能力从而感染下一级神经 元,而在下一级神经元中由于缺少G 蛋白的补充,VSV-ΔG 不能继续跨突触传播,从而可利用VSV-ΔG 实 现可控的跨单级神经突触标记神经网络。禽类肉瘤病毒(Aviansarcoma-leukosisvirus,ASLV) 的外膜蛋 白(EnvA) 可通过识别其同源的病毒受体TVA 介导病毒特异性地感染细胞,而TVA 只存在于禽类细胞中, 在哺乳动物神经元中无表达。利用EnvA 膜外区与跨膜区及RV G 蛋白胞内区融合得到的重组囊膜蛋白 包装缺陷型的VSV-ΔG(VSV-EnvA-ΔG),其感染神经元需要TVA 的表达,而其跨突触需要G 蛋白的补偿。 结合特异的表达Cre 重组酶的转基因动物品系及Cre-LoxP 系统,通过立体定位注射AAV ,可实现只在 特定区域特异类型神经元中表达TVA G 蛋白(VSV-GRV-G),从而利用VSV-EnvA-ΔG 实现对特异类 型神经元的顺向或逆向跨单级突触标记。此外,在利用AAV 介导特异类型神经元表达TVA VSV-G 蛋白 的同时,使该神经元中表达一种荧光蛋白,如,GFP;而使VSV-EnvA-ΔG 表达另一种荧光蛋白,如,RFP, 则起始感染的特异类型神经元可同时被标记为绿色和红色(黄色),而其直接输出的下一级神经元会被 标记为红色,从而可对特定类型神经元本身与其下游游神经元进行区分。在此基础上,使VSV 带上CHR2 及Gcamp 等基因,可实现对特异类型神经元的直接输出网络进行功能操纵及活动监测。


操作方法:首先将AAV-EF1α-DIO-GFP-TVA 与AAV-EF1α-DIO-VSVG 按照特定比例混合,然后向在特异 神经元中表达Cre的转基因小鼠目标脑区立体定位注射AAV 混合病毒。待AAV 病毒充分表达两周以上, 即可在同一区域立体定位注射VSV-EnvA-ΔG-dsRed,VSV 注射后12-14 h ,可对动物心脏灌注,利用4% PFA固定后取出脑组织制备样本观察标记结果。


注意事项:1、我们提供的AAV 目前均为2/9型或5型,病毒滴度均约为1X10E12 v.g / mL,推荐的病毒 混合比例为AAV-EF1α-DIO-GFP-TVA AAV-EF1α-DIO-VSVG (或AAV-EF1α-DIO-RVG)按照体积比1:2 混合。2、推荐的注射体积为混合后的总体积100-300 nL,注射速度为20-50 nL/min。若目标核团较小 或Cre 在该区域的外周围也有较多表达,为控制起始感染区域的特异性,可适当降低注射AAV 病毒的体 积及速度;反之,如需标记大范围或Cre 只在局部区域高特异性表达,可增加AAV 注射的体积与速度。 3、为保证VSV-EnvA-ΔG-dsRed 注射时已有高丰度表达的TVA 介导其感染神经元及G 蛋白补偿其跨突触 能力,AAV注射后需表达两周以上六周以内再注射VSV-EnvA-ΔG-dsRed,六周以外未进行相关实验评估, 但可尽量缩短 AAV 感染时间以缩短实验周期及避免 AAV 过表达外源TVA 及G 蛋白导致的细胞毒性及神 经网络改变;VSV 注射后,一般以12 h 为标准时间牺牲动物,而此时间也可控制在2-3天,对跨 突触标记结果无太大影响(所有实验样本都需保证采用一致的时间窗口)。



适用的神经科学问题:对特定神经网络进行跨单级和跨多级的顺向和逆向标记。特定区域特异类型神经 元的全脑单级或多级输入或输出网络标记,两个不同区域特异类型神经元被协同调控的单级输入或输出 网络模式,两个区域之间特异类型神经元的直接连接的检测及验证等。

1: VSV 拯救和扩增示意图

FIGURE1| Recovery, growth and analysis of rVSV-ΔG

图2: VSV病 毒的跨突触追踪策略 。(A)编码绿色 荧光蛋白等报告基因的rVSV 对特定神经网络进行跨单级或跨多级的逆 向或顺向标记。初始感染的细胞用星号表示。基因组包含G 蛋白的VSV 可以进行跨多突触传播。传播的方向取决于糖蛋 白的特性。感染的神经细胞用绿色标出。在一些情况下, 将TVA(带红色标签,mCherry)、G同时导入同一个起始神经 元中,再用EnvA 包装的携带绿色荧光蛋白GFP 基因的EnvA-VSV-GFP 可以特定感染这类起始神经元,在起始神经元中组 装成成熟的病毒粒子,感染上一级(逆行)或下一级(顺行)神经元,在上一级或下一级神经元中,只能进行RNA 复制 并表达外源蛋白,但不能产生成熟的病毒粒子继续跨突触感染,实现重组的VSV病毒按特定的方向传输。

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