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腺相关病毒载体在心脏中的研究及应用(一)

腺相关病毒载体在心脏中的研究及应用(一)

一、原理

     腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)属于细小病毒科(parvoviridae),病毒颗粒无包膜,结构为直径约20nm的正二十面体,是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造,可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体,极大增加了AAV的应用潜力。

     研究中采用的重组腺相关病毒(Recombination adeno-associated virus,rAAV)载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体,具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点,已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

     研究表明AAV1、AAV6、AAV8和AAV9等对心肌细胞具有较高的趋向性,可直接静脉注射感染,不需要复杂危险的开胸手术。现有的Ⅱ期临床试验,均使用AAV。利用AAV载体可实现心脏细胞广泛表达,还可以结合特异性启动子实现细胞类型的特异性表达,如需目的基因在心肌细胞中特异性表达,可使用特异性启动子,如心肌细胞特异性启动子cTnT、心肌细胞早期特异性启动子mNkx2.5。

     rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因,仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。rAAV的载体容量是4.7kb,插入外源目的片段大小不超过2.8kb。


表1.AAV靶向不同的器官及组织推荐使用对应血清型,注射方法及剂量

备注:

1.血清型:同一位置选择不同注射方式,所适用的血清型会存在差异;

2.注射量:不同文献,病毒供应商不同,滴度不同,剂量会有差异;

3.以上数据大多查阅文献所得,仅供参考。


二、注射方法

     总体上包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定(多)点注射、心包内注射(介于心肌与心包膜之间),其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。最常用的方法是心肌定点注射和尾静脉注射。

注意事项:

1)心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行,由于开胸腔手术需要辅助呼吸,对手术操作要求较高。注射体积约为20μL左右。

2)心肌内定点注射时,使用27-29G的针头,每点注射约2-5μL,注意缓慢注射,病毒在注射的局部点附近感染较好,扩散有限。并且心脏定点注射需要开胸并辅助呼吸,对手术操作要求较高,也需要花费更长的操作时间。
3)由于心脏血流快,或者由于病毒进入血液系统以后,肝脏的首过效应,使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏(反而在肝脏的富集程度更高),因此相比其他器官,尾静脉注射需要更高的病毒量。


三、应用案例

1)

图1.五种AAV血清型用于心脏基因递送

左心室前壁单次注射cTnT启动表达Luc的5种血清型AAV载体。活体成像及荧光素酶活性测定实验显示AAV9组心脏荧光素酶活性最高。表明AAV9是目前最有效的用于直接注射转导成年小鼠心脏的血清型。

参考文献:

Prasad KM, Smith RS, Xu Y, French BA. J Gene Med. 2011.


2)

图2.测试心脏基因传递的特异启动子

活体成像显示CMV广泛表达,荧光素酶活性测定实验进一步表示cTNT启动基因在心脏特异表达。

图3.5种AAV血清型心肌细胞特异性基因传递

颈静脉注射cTnT启动表达Luc的5种血清型AAV载体,活体成像及荧光素酶活性测定实验显示AAV9组心脏荧光素酶活性最高。

图4.5种血清型AAV载体不同注射量基因表达效果

颈静脉注射cTnT启动表达eGFP的5种血清型AAV载体,4周后心脏冰冻切片荧光检测显示AAV9 1×1011vg病毒量时eGFP在心肌细胞表达最强。

参考文献:

Prasad KM, Xu Y, Yang Z,et al. Gene Ther. 2011.


3)用于绘制小鼠心脏解剖和生理的AAV-PHP.S(眼球后静脉丛注射)

a 整个心脏:

AAV-PHP.S(CAG-NLS-GFP),注射剂量为1×1012vg,4周后取材切片观察。

结果:AAV-PHP.S比当前标准AAV9更高效靶向心脏。

b 心肌细胞

ssAAV-PHP.S:CAG-XFPs(C57BL/6J),3个病毒的混合物,每个病毒3.3×1011vg,总量是1×1012vg,11天后取材切片观察。

结果:单个心肌细胞相互之间很容易区分。

c 心神经细胞

ssAAV-PHP.S:CAG-DIO-XFPs(TRPV1-IRES-Cre小鼠),3个病毒的混合物,每个病毒1×1012vg,总量是3×1012vg,2周后取材切片观察。

d 心内神经节细胞

ssAAV-PHP.S:Ef1α-DIO-ChR2-eYFP(ChAT-IRES-Cre小鼠),注射剂量为1×1012vg,3周后取材切片观察。

参考文献:

Challis RC, Ravindra Kumar S, Chan KY, et al. Nat Protoc. 2019.


4)心肌细胞中FXN-HA的高表达与琥珀酸脱氢酶(SDH)酶活性受损有关

     5周龄时MCK小鼠静脉注射AAVRh.10-CAG-hFXN-HA载体治疗,并于12周龄处死取材切片行心脏组织学观察,高表达组AAV注射量是5×1013vg/kg,hFXN-HA的表达量是10,927ng/mg,低表达组AAV注射量是2.5×1013vg/kg,hFXN-HA的表达量是695ng/mg,5周龄时注射 NaCl的12周龄野生型(WT)小鼠以及9周龄MCK小鼠均作为对照组。结果表明高表达组心脏切片中hFXN-HA表达最强的区域但SDH酶活受损。低表达组中没发现类似现象。高表达组心脏表面SDH酶活阳性量化后是73%±2%,WT NaCl组则是83%±4%。表明不到12%的整个心脏表面被影响。

参考文献:

Belbellaa B, Reutenauer L, Messaddeq N, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020.

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