腺相关病毒载体在心脏中的研究及应用（一）

一、原理

     腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），病毒颗粒无包膜，结构为直径约20nm的正二十面体，是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体，极大增加了AAV的应用潜力。

     研究中采用的重组腺相关病毒（Recombination adeno-associated virus,rAAV）载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

     研究表明AAV1、AAV6、AAV8和AAV9等对心肌细胞具有较高的趋向性，可直接静脉注射感染，不需要复杂危险的开胸手术。现有的Ⅱ期临床试验，均使用AAV。利用AAV载体可实现心脏细胞广泛表达，还可以结合特异性启动子实现细胞类型的特异性表达，如需目的基因在心肌细胞中特异性表达，可使用特异性启动子，如心肌细胞特异性启动子cTnT、心肌细胞早期特异性启动子mNkx2.5。

     rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。rAAV的载体容量是4.7kb，插入外源目的片段大小不超过2.8kb。

表1.AAV靶向不同的器官及组织推荐使用对应血清型，注射方法及剂量

备注：

1.血清型:同一位置选择不同注射方式，所适用的血清型会存在差异；

2.注射量:不同文献，病毒供应商不同，滴度不同，剂量会有差异；

3.以上数据大多查阅文献所得，仅供参考。

二、注射方法

     总体上包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定（多）点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。最常用的方法是心肌定点注射和尾静脉注射。

注意事项：

1）心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求较高。注射体积约为20μL左右。

2）心肌内定点注射时，使用27-29G的针头，每点注射约2-5μL，注意缓慢注射，病毒在注射的局部点附近感染较好，扩散有限。并且心脏定点注射需要开胸并辅助呼吸，对手术操作要求较高，也需要花费更长的操作时间。
3）由于心脏血流快，或者由于病毒进入血液系统以后，肝脏的首过效应，使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏（反而在肝脏的富集程度更高），因此相比其他器官，尾静脉注射需要更高的病毒量。

三、应用案例

1）

图1.五种AAV血清型用于心脏基因递送

左心室前壁单次注射cTnT启动表达Luc的5种血清型AAV载体。活体成像及荧光素酶活性测定实验显示AAV9组心脏荧光素酶活性最高。表明AAV9是目前最有效的用于直接注射转导成年小鼠心脏的血清型。

参考文献：

Prasad KM, Smith RS, Xu Y, French BA. J Gene Med. 2011.

2）

图2.测试心脏基因传递的特异启动子

活体成像显示CMV广泛表达，荧光素酶活性测定实验进一步表示cTNT启动基因在心脏特异表达。

图3.5种AAV血清型心肌细胞特异性基因传递

颈静脉注射cTnT启动表达Luc的5种血清型AAV载体，活体成像及荧光素酶活性测定实验显示AAV9组心脏荧光素酶活性最高。

图4.5种血清型AAV载体不同注射量基因表达效果

颈静脉注射cTnT启动表达eGFP的5种血清型AAV载体，4周后心脏冰冻切片荧光检测显示AAV9 1×10¹¹vg病毒量时eGFP在心肌细胞表达最强。

参考文献：

Prasad KM, Xu Y, Yang Z,et al. Gene Ther. 2011.

3）用于绘制小鼠心脏解剖和生理的AAV-PHP.S（眼球后静脉丛注射）

a 整个心脏：

AAV-PHP.S（CAG-NLS-GFP），注射剂量为1×10¹²vg，4周后取材切片观察。

结果：AAV-PHP.S比当前标准AAV9更高效靶向心脏。

b 心肌细胞

ssAAV-PHP.S:CAG-XFPs（C57BL/6J），3个病毒的混合物，每个病毒3.3×10¹¹vg，总量是1×10¹²vg，11天后取材切片观察。

结果：单个心肌细胞相互之间很容易区分。

c 心神经细胞

ssAAV-PHP.S:CAG-DIO-XFPs（TRPV1-IRES-Cre小鼠），3个病毒的混合物，每个病毒1×10¹²vg，总量是3×10¹²vg，2周后取材切片观察。

d 心内神经节细胞

ssAAV-PHP.S:Ef1α-DIO-ChR2-eYFP（ChAT-IRES-Cre小鼠），注射剂量为1×10¹²vg，3周后取材切片观察。

参考文献：

Challis RC, Ravindra Kumar S, Chan KY, et al. Nat Protoc. 2019.

4）心肌细胞中FXN-HA的高表达与琥珀酸脱氢酶（SDH）酶活性受损有关

     5周龄时MCK小鼠静脉注射AAVRh.10-CAG-hFXN-HA载体治疗，并于12周龄处死取材切片行心脏组织学观察，高表达组AAV注射量是5×10¹³vg/kg，hFXN-HA的表达量是10,927ng/mg，低表达组AAV注射量是2.5×10¹³vg/kg，hFXN-HA的表达量是695ng/mg，5周龄时注射 NaCl的12周龄野生型（WT）小鼠以及9周龄MCK小鼠均作为对照组。结果表明高表达组心脏切片中hFXN-HA表达最强的区域但SDH酶活受损。低表达组中没发现类似现象。高表达组心脏表面SDH酶活阳性量化后是73%±2%，WT NaCl组则是83%±4%。表明不到12%的整个心脏表面被影响。

参考文献：

Belbellaa B, Reutenauer L, Messaddeq N, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020.