1. mGRASP

传统哺乳动物突触可视化研究，长期受限于电镜技术的高成本、低通量，以及传统荧光示踪无法区分“轴突-树突物理接触”与“真实功能性突触”的痛点。2011年Jinhyun Kim等人在Nature Methods发表的研究“mGRASP enables mapping mammalian synaptic connectivity with light microscopy”，开发出首个适配哺乳动物大脑的突触光学可视化工具mGRASP（哺乳动物跨突触伴侣绿色荧光蛋白重构），突破了这一瓶颈。

技术原理

mGRASP基于分裂型绿色荧光蛋白（Split GFP）的功能互补特性设计，分别构建了精准锚定突触前膜的pre-mGRASP（携带GFP11片段）与突触后膜的post-mGRASP（携带GFP1-10片段）。两个片段单独表达时无荧光活性，仅当表达二者的神经元形成真实突触时（~20 nm间隙），才会在突触间隙重构出完整且有活性的GFP（该过程不可逆），在激发光照射下发出绿色荧光，从根源上排除了假阳性干扰，且经验证不影响突触数量，未观察到细胞毒性或异常突触发生。

图1. mGRASP的作用原理及核心组件结构（Kim, Jinhyun et al., Nature methods, 2011.）

应用示例

为了在单细胞分辨率下验证mGRASP工具的有效性，研究团队设计了针对海马CA3-CA1已知环路的特异性验证实验。该实验采用跨时期递送策略：首先，在小鼠胚胎期通过子宫内电穿孔技术，将改良型（i）Cre重组酶的质粒递送至小鼠胚胎右脑室，利用电穿孔天然的低转染率实现稀疏标记；随后，在小鼠成年期（出生2个月后），将Cre非依赖型pre-mGRASP病毒AAV-CAG-pre-mGRASP-mCerulean注射至大脑左半球CA3区，同时将Cre依赖型post-mGRASP病毒AAV-CAG-Jx-rev-post-mGRASP-2A-dTomato注射至右半球CA1区。结果显示，在青色mCerulean标记的CA3轴突与红色dTomato标记的CA1树突的交汇处，可清晰观察到重构的mGRASP绿色荧光呈点状分布于树突棘，成功在单细胞水平上可视化了该环路的真实突触连接。

图2. mGRASP在海马CA3-CA1连接中的重构（Kim, Jinhyun et al., Nature methods, 2011.）

2.eGRASP

传统哺乳动物突触可视化技术在实现单群体突触标记后，仍面临核心瓶颈：无法同时区分投射至同一突触后神经元的两类不同突触前群体，如记忆印迹细胞（engram cells）与非印迹细胞，从而难以解析记忆形成的突触学基础。2018年Jun-Hyeok Choi等人在Science发表的研究“Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation”，开发了增强型GRASP（eGRASP）技术，并进一步升级为双色标记系统dual-eGRASP，突破了这一技术壁垒。

 

技术原理

dual-eGRASP基于Split GFP的功能互补特性完成核心优化：通过引入促GFP重构的弱相互作用结构域与GFP优化突变，显著提升了荧光信号强度；同时创新开发青、黄双色荧光版本，将颜色决定结构域与通用互补结构域分别置于突触前pre-eGRASP和突触后post-eGRASP，可同时可视化同一突触后神经元上两类不同突触前群体的突触。两类片段单独表达时无荧光活性，仅当神经元形成真实突触时才会在突触间隙重构出对应颜色的荧光蛋白，实现不同来源突触的特异性区分。经验证，eGRASP本身不诱导非预期的突触传递增强，不影响基础突触功能。

图3. dual-eGRASP双色标记原理、细胞水平验证及脑区突触可视化（Choi, Jun-Hyeok et al., Science, 2018.）

应用示例

为验证dual-eGRASP对记忆印迹细胞突触连接的标记能力，研究团队采用Fos-rtTA（神经元活性依赖四环素诱导系统）结合AAV载体，实现了印迹细胞特异性标记与基因递送，进而对四类突触开展并行标记：通过Fos-rtTA系统（情境恐惧条件反射（CFC）实验前2小时注射强力霉素），将post-eGRASP+膜定位红色荧光蛋白mScarlet-I单侧表达于CA1印迹细胞，黄色pre-eGRASP表达于对侧CA3印迹细胞，标记印迹-印迹（E-E）突触；同时以低滴度iCre AAV+高滴度Cre依赖的青色pre-eGRASP AAV，在对侧CA3神经元随机表达青色pre-eGRASP，并在同侧CA1稀疏表达post-eGRASP+膜定位红外荧光蛋白iRFP670标记非印迹细胞，同步可视化非印迹-非印迹（N-N）、E-N、N-E突触。结果显示，情境恐惧记忆形成后，E-E突触密度显著高于E-N突触（N-N与N-E无差异），且E-E突触的树突棘头直径与体积显著大于N-E突触（N-N与E-N无差异），表明记忆形成特异性增强了印迹细胞间的结构与连接密度。

图4. dual-eGRASP标记的四类突触及E-E突触的密度与结构增强（Choi, Jun-Hyeok et al., Science, 2018.）

3.SynapShot

以mGRASP、eGRASP为代表的split FP类突触标记技术，虽实现了哺乳动物脑内突触的特异性可视化，但受限于荧光蛋白片段的不可逆结合、重构成熟耗时长的核心缺陷，无法实时追踪突触的结构动态变化，难以解析生理活动与行为过程中突触的双向可塑性。2024年Seungkyu Son等人在Nature Methods发表的研究“Real-time visualization of structural dynamics of synapses in live cells in vivo”，开发了SynapShot技术，突破了传统突触可视化工具无法实现活体实时动态监测的技术壁垒。

技术原理

二聚化依赖荧光蛋白（ddFPs）由两个淬灭单体（拷贝A、B）组成，只有当二者发生异源二聚化时，拷贝A中发色团才能被激活发光，此结合过程可逆。SynapShot基于该特性设计，将ddFPs的拷贝A、B分别插入突触前分子神经连接蛋白1β（NRX1β）和突触后分子神经配蛋白1（NLG1），构建了Pre-SynapShot与Post-SynapShot。二者单独表达无荧光，仅当表达二者的神经元形成真实突触时，拷贝A、B在突触间隙发生异源二聚化（可逆），于激发光下呈现明亮荧光，从而实时反映突触双向动态变化。此外，研究人员开发了绿（G-SynapShot）、红（R-SynapShot）双色版本，可同步可视化两类突触群体。经验证，SynapShot的表达不改变树突棘数量与大小，也不影响神经元微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率与振幅。

图5. SynapShot的工作原理及细胞验证（Son, Seungkyu et al., Nature methods, 2024.）

应用示例

为验证SynapShot在清醒行为小鼠中的突触动态监测能力，研究团队选择次级躯体感觉皮层（S2）-初级运动皮层（M1）环路，采用AAV靶向递送系统开展实验：向小鼠S2区注射Cre非依赖型pre-SynapShot病毒AAV2/5-CAG-GA-Nrx1bc-Myc，向M1区注射Cre依赖型post-SynapShot病毒AAV2/5-CAG-DIO-B3-NL1C-2A-mScarlet与低滴度AAV1-CaMKIIO.4-Cre，实现M1神经元特异性稀疏标记。对清醒跑动（球形跑步机）与麻醉状态小鼠的M1树突棘进行1小时活体双光子成像。结果显示，清醒状态下44.6%的突触位点荧光增强，仅4.6%减弱，反映行为相关突触双向可塑性；麻醉状态下荧光信号整体下降（43.3%减弱），仅7.2%增强。传统mGRASP在相同条件下荧光信号未出现动态变化。（点击阅读全文→IF=48【新品推荐】Nat Methods｜SynapShot——实现活体活细胞突触结构动态的实时可视化）

图6. SynapShot在小鼠S2-M1环路中对清醒行为相关突触动态的实时监测（Son, Seungkyu et al., Nature methods, 2024.）

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