Cn|En

技术与服务

慢病毒载体在肺脏中的研究及应用

慢病毒载体在肺脏中的研究及应用

一、原理

     慢病毒是逆转录病毒科的一个属,属于单链RNA病毒,是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)的基础上发展起来的病毒载体。慢病毒的优点是可以将靶基因整合入宿主的基因组中持续稳定的表达,引起的免疫反应较为温和。

     慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右,但一般建议插入的片段大小不超过5kb,这样包装出来的病毒滴度较高,若超过6kb则会显著降低病毒滴度。实际病毒包装中,常需要插入报告基因(如GFP)和抗性基因(如Puro),这使得目的片段的容量进一步缩小至3kb左右。目前通过载体优化,例如删去不必要的基因,减小启动子长度,可使目的基因的片段容量扩大到4kb左右。


二、注射方法

     肺部病毒感染常用的方法有系统注射(尾静脉注射或腹腔注射)、及鼻内或气管内递送(经呼吸道)等。


三、应用案例

     体重18-22g的C57/BL6小鼠鼻内滴注表达AngsiRNA或NCsiRNA慢病毒,48h后腹腔注射15mg/kg的LPS建立小鼠ALI(急性肺损伤)。实验所用小鼠总计120只,分为2部分,第一部分90只随机分为6组,即生理盐水组,LPS组,AngsiRNA组,NCsiRNA组,LPS+AngsiRNA组,LPS+NCsiRNA组,每组15只,取5只采集肺样本用于RNA和蛋白提取,并固定用于Angptl4和SPC的组织学评估和免疫荧光分析。再取5只收集支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA检测TNFα和IL6水平或BCA法测定总蛋白质含量。此外,为评估AngsiRNA对LPS诱导的ALI相关肺水肿的影响,最后5只取肺组织用于测定湿/干重比。第二部分30只随机分为2组:AngsiRNA+LPS组和NCsiRNA+LPS组,每组15只小鼠用于评估存活率。

Angptl4敲低减轻LPS处理小鼠肺部炎症反应

     LPS给药6h后评估肺损伤程度,肺损伤的组织学特征,包括中性粒细胞浸润和间质水肿,均未在生理盐水组、AngsiRNA组及NCsiRNA组中观察到,表明慢病毒给药不会在小鼠肺部产生炎症反应。NCsiRNA+LPS组中性粒细胞浸润程度与LPS组相似,而AngsiRNA给药减少LPS诱导的中性粒细胞浸润。进一步检测小鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)mRNA表达水平证实组织学检查结果。结果表示AngsiRNA+LPS组MPO水平显著低于LPS组和NCsiRNA+LPS组。进一步证明Angptl4对肺部炎性细胞因子表达的影响,在小鼠肺和BALF中测定TNFα、IL-6水平。结果表明AngsiRNA+LPS组TNFα、IL-6的mRNA和蛋白水平明显低于LPS组和NCsiRNA+LPS组。LPS组与NCsiRNA+LPS组比较,二者TNFα、IL-6表达无显著差异。这些结果表明沉默Angptl4减轻LPS诱导ALI小鼠肺组织炎症。

沉默angptl4防止LPS诱导ALI小鼠血管渗漏并降低死亡率

     血管通透性增加是ALI的一个特征,LPS是导致屏障功能障碍的主要因素之一。为弄清Angptl4对LPS诱导的血管渗漏的影响,测定肺湿/干重比,结果表示Angptl4敲低显著减少LPS诱导的肺水肿,LPS给药后出现明显肺水肿,而AngsiRNA+LPS组肺水肿明显降低。BALF蛋白总量增加是LPS诱导血管渗漏的另一个标志,Angptl4敲低显著减少BALF蛋白含量。记录LPS注射后7d的存活率。结果表明接受AngsiRNA+LPS的小鼠的总存活率为73.3%,而NCsiRNA+LPS组在7天内的总生存率为33.3%,表明Angptl4敲低能阻碍LPS诱导的ALI进展,延长小鼠的生存期。




参考文献:

Guo L, Li S, Zhao Y,et al.J Cell Physiol. 2015.






信息订阅

我们将及时向您推送最新产品资讯

免责声明| 法律支持| 联系方式

地址:中国武汉东湖高新区光谷七路128号中科开物产业园1号楼
市场:027-65023363
行政/人事:027-62439686
邮箱:marketing@brainvta.com

Copyright ©2021 武汉枢密脑科学技术有限公司. All RIGHTS RESERVED.
鄂ICP备2021009124号 DIGITAL BY VTHINK