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慢病毒载体在肝脏中的研究及应用

慢病毒载体在肝脏中的研究及应用

一、原理

     慢病毒是逆转录病毒科的一个属,属于单链RNA病毒,是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)的基础上发展起来的病毒载体。慢病毒的优点是可以将靶基因整合入宿主的基因组中持续稳定的表达,引起的免疫反应较为温和。

     慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右,但一般建议插入的片段大小不超过5kb,这样包装出来的病毒滴度较高,若超过6kb则会显著降低病毒滴度。实际病毒包装中,常需要插入报告基因(如GFP)和抗性基因(如Puro),这使得目的片段的容量进一步缩小至3kb左右。目前通过载体优化,例如删去不必要的基因,减小启动子长度,可使目的基因的片段容量扩大到4kb左右。


二、注射方法

     常用的方法有尾静脉注射、腹腔注射及肝门静脉注射。

注意事项:

1)由于心脏血流快,或者由于病毒进入血液系统以后,肝脏的首过效应,使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏(反而在肝脏的富集程度更高),因此相比其他器官,尾静脉注射需要更高的病毒量。



三、应用案例


肝脏中FOXA2的上调可改善纤维生成

     C57Bl/6J小鼠第一次CCl4注射后2周尾静脉注射LV-FOXA2或LV-Control,CCl4处理5周后分析小鼠纤维化肝脏。Western blot检测FOXA2过表达组分离自小鼠肝脏的原代肝细胞、HSC(肝星状细胞)中FOXA2蛋白表达,结果显示均显著上调。免疫组化评估纤维化肝脏中FOXA2和α-SMA表达,结果表明FOXA2过表达组肝细胞(黑色箭头)和肝非实质细胞(红色箭头)中FOXA2表达增强,α-SMA表达减弱。H&E染色和天狼星红染色用于检查病理改变和胶原沉积。天狼星红染色的半定量分析表示天狼星红阳性区域明显减少。实时PCR和Western blot检测纤维化肝脏中FOXA2、成纤维标志物(Acta2和Col1a1)及α-SMA的表达水平,结果显示FOXA2表达增强,而Acta2和Col1a1表达显著下调,α-SMA表达也降低。另外,纤维化小鼠FOXA2的基因传递可明显减少肝脏中羟脯氨酸含量。综上表明,肝脏中FOXA2的过表达减轻肝脏纤维化。

参考文献:

Wang W, Yao LJ, Shen W, et al. Sci Rep. 2017.


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