腺相关病毒载体在肝脏中的研究及应用（二）

应用案例（续）

rAAV在代谢性肝病中介导的基因编辑

     X染色体遗传的高血氨症是由OTC基因突变引起的。该基因外显子4最后一个碱基发生G—>A的突变，导致RNA剪接不能正常进行，使得mRNA和蛋白表达水平只有正常的5%。这种突变小鼠只能在基础饲料喂养下存活，在高蛋白饲料喂养下会产生高血氨症并致死。研究人员使用分离自金黄色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）并基于AAV8（对肝脏有高嗜性）的双AAV系统策略，纠正新生spfash小鼠点突变。spfash小鼠出生后第2天（p2）颞静脉注射AAV8.sgRNA1.donor载体（包含1.8kb OTC供体模板，5×10¹¹GC/只）和AAV8-TBG-SaCas9载体（5×10¹⁰GC/只），于3周、8周处死小鼠取肝脏分析。非靶向spfash小鼠出生后p2注射AAV8.SaCas9（5×10¹⁰GC/只）和AAV8.control.donor（5×10¹¹GC/只），8周后取肝脏。未处理的WT小鼠和spfash小鼠作为对照组。

     免疫组化分析肝脏组织切片OTC表达，结果显示双AAV载体系统介导的基因编辑可高效恢复OTC基因表达，OTC阳性肝细胞明显增多。肝匀浆OTC酶活性测定表示经校正spfash小鼠OTC酶活显著增强。肝组织定量PCR检测到OTC mRNA表达水平上调。均提示双AAV载体系统介导的基因编辑对靶基因具有高的校正水平。

图1.AAV.CRISPR-SaCas9对spfash小鼠肝脏OTC位点的体内基因校正

图2.新生阶段spfash小鼠肝脏OTC表达通过AAV8.CRISPR-SaCas9介导的基因校正得以有效恢复

参考文献：

Yang Y, Wang L, Bell P, et al. Nat Biotechnol. 2016.