腺相关病毒载体在心脏中的研究及应用（二）

应用案例（续）

1）rAAV在心脏疾病例如心力衰竭和心肌梗死治疗中的应用

     在医学领域，心力衰竭是一种难治疗的高发病率和高死亡率的疾病，而通过基因治疗来加强心肌收缩力，给晚期心力衰竭病人带来了希望。rAAV介导的肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）基因疗法在临床上已经取得了较好的效果，Lyon AR等在大鼠构建心肌梗死（MI）后慢性心力衰竭（HF）模型，至少梗死16周后大鼠尾静脉注射总量为2×1011drp（DRP：DNase resistant particles的缩写。表示能抵抗DNase1消化的病毒颗粒数）的300μL AAV9.SERCA2a，注射后4-6周取材。慢性梗死大鼠心脏心室中段10μm切片H&E染色显示梗死面积大。Western blot检测结果显示经AAV9.SERCA2a感染的HF大鼠，能够恢复心肌SERCA2a和肌集钙蛋白（CSQ）表达水平。对左心室Emax（左心室17节段最大位移）、能量效率、舒张末期P（压力）V（容积）关系（EDPVR）和左心室舒张末期压力（LVEDP）进行测量发现，HF大鼠通过SERCA2a基因传递能提高Emax，降低EDPVR、LVEDP，改善心肌能量学，表明SERCA2a基因传递至衰竭心肌细胞可降低基底Ca2+水平，并以能量有利的方式启动反向重塑，从而改善左心室功能，达到治疗心力衰竭的效果。

图1.基因传递SERCA2a能改善HF大鼠左心室功能

参考文献：

Lyon AR, Bannister ML, Collins T, et al. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011.

2）

     C57BL/6J未损伤小鼠尾静脉注射100μL生理盐水溶解的3.0×10¹¹GC rAAV9-CMV-Wnt11，2周后Western blot检测Wnt11蛋白表达。结果显示AAV9可以介导Wnt11实现心脏高水平蛋白表达。

图2.Wnt11在心脏中蛋白表达水平

     手术诱导MI前的1周，接受GFP表达小鼠骨髓移植的野生型（WT）小鼠尾静脉注射3.0×10¹¹GC编码Wnt11（rAAV9-CMV-Wnt11）或LacZ（rAAV9-CMV-LacZ）的rAAV9载体，MI8周后监测存活率。通过结扎LAD（左前降支）冠状动脉的近端部位诱发心肌梗死，从而诱发更大的梗死，通常导致相对较高的死亡率。然而，所有注射rAAV9-Wnt11的小鼠存活到第8周处死时，同一时间内内40%以上rAAV9-LacZ处理的小鼠死亡。尸检发现死亡小鼠有胸腔积液的证据，表明死亡原因是心力衰竭。

     为了确定rAAV9-Wnt11治疗是否能增强缺血性损伤后的心功能，损伤前超声心动图评估左室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、每搏输出量（SV），并于心肌梗死后存活小鼠第1天和第2、4、8周重复评估。在所有每周时间点，注射rAAV9-Wnt11的小鼠LVEF、SV显著高于注射rAAV9-LacZ的小鼠，这些显著差异不能归因于rAAV9-LacZ处理组的死亡率，因为存活的rAAV9-LacZ处理小鼠在第2周和第4周的LVEF和SV均值高于随后死亡小鼠。另一方面，Wnt11的表达并没有显著改变LVEDV和左心室收缩末期容积（LVESV）。

     Wnt11基因表达对梗死面积的潜在影响通过存活至第8周的小鼠心脏切片天狼星红染色测量纤维化程度来评估。rAAV9-Wnt11治疗小鼠明显比rAAV9-LacZ处理小鼠纤维化范围小，但是两组之间差异没有达到统计学意义。然而，在非梗死区域rAAV9-Wnt11治疗后纤维化和血管周围纤维化明显低于rAAV9-LacZ处理后。因此，相当一部分与心肌恢复期间Wnt11基因表达相关的益处可归因于心脏非梗死区的改善。

图3.心肌梗死（MI）恢复期间Wnt11表达可改善存活率、心功能和减少心脏非梗死区的纤维化

参考文献：

Morishita Y, Kobayashi K, Klyachko E, et al. Sci Rep. 2016.

3）rAAV在心脏疾病中介导的基因编辑

     Carroll KJ等构建了带有eSpCas9（1.1）的心脏特异性转基因小鼠，通过Myh6基因的启动子（α-MHC）驱动Cas9在心肌的特异性表达。α-MHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。这个工具小鼠能够解决实验过程中Cas9在心脏递送和表达的难题。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏长期高水平的表达，而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。Cas9转基因小鼠只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现编辑效率的提高。

     研究中首先将U6启动子控制下靶向Myh6基因外显子3的 sgRNA与CMV驱动的ZsGreen报告基因一起克隆到AAV9骨架中，并在出生后第10天（P10）的小鼠腹腔注射1×1012vg的病毒，5-6周后进行分析。qPCR检测显示Cas9小鼠中AAV传递sgRNA后心脏Myh6表达显著下调（降低50%以上）。对编辑心脏结构观察显示，心脏极端扩张和肥大，心室壁变薄和心房和心室大量扩张。因此，这种方法成功得到同时发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。该方法可用于疾病建模，并能够快速编辑心脏中基因。

图3.Cas9心脏特异性转基因小鼠构建及验证

图4.通过AAV递送sgRNA到Cas9心脏特异性转基因小鼠实现Myh6敲除，造成心脏结构改变

参考文献：

Carroll KJ, Makarewich CA, McAnally J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016.