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腺相关病毒载体在肝脏中的研究及应用(一)

腺相关病毒载体在肝脏中的研究及应用(一)

一、原理

     腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)属于细小病毒科(parvoviridae),病毒颗粒无包膜,结构为直径约20nm的正二十面体,是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造,可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体,极大增加了AAV的应用潜力。

     研究中采用的重组腺相关病毒(Recombination adeno-associated virus,rAAV)载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体,具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点,已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

     利用AAV载体可实现脏细胞广泛表达,还可以结合特异性启动子实现细胞类型的特异性表达,如AAV8型对肝脏有较好的趋向性特异性启动子TBG可驱动外源基因在肝细胞中特异表达。

     rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因,仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。rAAV的载体容量是4.7kb,插入外源目的片段大小不超过2.8kb。


表1.AAV靶向不同的器官及组织推荐使用对应血清型,注射方法及剂量

备注:

1. 血清型:同一位置选择不同注射方式,所适用的血清型会存在差异;

2. 注射量:不同文献,病毒供应商不同,滴度不同,剂量会有差异;

3. 以上数据大多查阅文献所得,仅供参考。


二、注射方法

     常用的方法有尾静脉注射、腹腔注射及肝门静脉注射。

注意事项:

1)由于心脏血流快,或者由于病毒进入血液系统以后,肝脏的首过效应,使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏(反而在肝脏的富集程度更高),因此相比其他器官,尾静脉注射需要更高的病毒量。


三、应用案例

1)

     6-8周龄成年C57BL/6小鼠尾静脉注射1×1011GC的AAV8-TBG-GFP,注射7天后对肝组织切片行GFP免疫荧光染色,结果显示GFP在肝细胞中高效表达。


     新生C57BL/6小鼠出生后24小时内颞静脉注射2.5×1010GC的AAV8-TBG-EGFP,7天后对肝组织切片行GFP免疫荧光染色,结果显示GFP在肝细胞中高效表达。

参考文献:

Bell P, Wang L, Gao G, et al. Mol Genet Metab. 2011.


2)基因功能研究


     构建的病毒载体为AAV2/8-CMV-b-Globin-eGFP-WPRE-hgH polyA-H1-Ephx2-shRNA。Ephx2基因编码可溶性环氧化物水解酶(sEH)蛋白。EGFP在病毒注射后14天在肝脏特异性表达;AAV-Ephx2-shRNA注射2周后选择性地降低肝脏单体sEH的表达。


参考文献:

Qin XH, Wu Z, Dong JH, et al.Cell Rep. 2019.


3)


糖尿病小鼠肝脏H19表达慢性增加

     相比于正常饲料喂养(NC)小鼠,高脂饲料喂养(HFD)小鼠体重增加更多,空腹血糖升高,并变得葡萄糖不耐受[葡萄糖耐量试验(GTT)],这些小鼠肝脏中H19表达也增加。这些结果表明肝脏H19表达增加与葡萄糖稳态受损之间存在正相关关系。

肝脏特异性H19过表达促进HGP、高血糖和胰岛素抵抗

     为了确定肝脏H19表达增加是否与糖代谢受损相关,小鼠尾静脉注射1×1010GC的AAV8-TBG-H19(AAV-H19)实现小鼠全长H19在肝脏特异性表达,H19功能增强小鼠的空腹血糖和胰岛素水平均升高。丙酮酸耐受性试验(PTT)显示丙酮酸注射后血糖水平更高。H19过表达的小鼠也具有葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗(胰岛素糖耐量试验ITT)。总的来说,这些结果表明肝脏中H19水平升高增加HGP(肝脏葡萄糖生成)并损害葡萄糖稳态。


参考文献:

Zhang N, Geng T, Wang Z,et al. JCI Insight. 2018.


4)rAAV在肝脏疾病如肝纤维化治疗中的应用


     C57Bl/6J小鼠第一次CCl4注射后1周尾静脉注射4×1011vgAAV8-TBG-FOXA2形成肝细胞特异性FOXA2过表达模型。CCl4注射5周后处死小鼠,免疫荧光和免疫组化检测显示在FOXA2基因传递后明显更多FOXA2染色定位于肝细胞;天狼星红染色显示FOXA2过表达组细胞外基质(ECM)沉积减少(胶原纤维数量减少);同时,FOXA2过表达组小鼠肝脏中羟脯氨酸含量更低;免疫组化、蛋白印迹、定量PCR结果显示FOXA2过表达组小鼠肝脏中促纤维化标志物α-SMA和Col1a1蛋白和mRNA表达水平显著下降,这些结果表明肝细胞中FOXA2的上调显著缓解肝纤维化。


参考文献:

Wang W, Yao LJ, Shen W, et al., Sci Rep. 2017.



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