以下文章来源于逻辑神经科学 ，作者课题组 

撰文︱董海龙/赵广超团队

日常生活中，严重的外部压力应激，如惊吓、挫败、社交冲突等，常引发严重的不良感受。这些应激刺激未能及时得到缓解可能会引起较为显著的焦虑、抑郁表现，引发神经精神疾病。2022年7月1日，空军军医大学西京医院董海龙课题组与英国伦敦帝国学院William Wisden & Nicolas P. Franks课题组在Science杂志发表的合作研究中揭示了急性应激通过介导恢复性睡眠从而缓解焦虑情绪的环路调节机制（A specific circuit in the midbrain detects stress and induces restorative sleep）（喻晓、赵广超为共同第一作者）。然而，持续的慢性应激是否会引起睡眠结构的显著改变，及其对相关功能环路的特异性影响尚未得到充分阐明。

近日，空军军医大学西京医院麻醉科、麻醉学教育部重点实验室董海龙教授、赵广超副教授团队在《Neuron》发表题为“Hyperexcitable VTA-mPFC dopaminergic circuit disrupts sleep spindle and mediates sleep fragmentation after chronic social defeat stress”的研究性论文。该研究进一步揭示了慢性应激通过诱导腹侧被盖区多巴胺能（VTA^DA）神经元放电模式从紧张性（Tonic）向簇状（Burst）病理性转变，导致内侧前额叶皮层（mPFC）内多巴胺过量释放，进而破坏睡眠纺锤波的连续性与非快速眼动睡眠（NREMs）稳定性，为应激性睡眠障碍的神经环路机制和潜在靶向干预提供了全新的理论框架。

研究团队首先建立慢性社交挫败应激（CSDS）小鼠模型，结合睡眠记录系统评估睡眠结构。结果显示，CSDS小鼠NREMs总时长增加，但单次NREMs片段显著缩短，睡眠-觉醒转换增多，呈现典型的“睡眠碎片化”表型。值得注意的是，即使小鼠在应激后表现为行为表型异质性分化，上述睡眠异常均普遍存在，提示睡眠障碍是应激的一种保守性生理反应（图1）。

图1. CSDS后小鼠睡眠结构变化

进一步分析发现，应激后睡眠纺锤波密度显著下降，睡眠纺锤波形态异常（持续时间缩短、不对称性增加等）。睡眠纺锤波密度与NREMs片段持续时间和δ波功率均呈正相关关系，这种关系在生理和CSDS条件下均保持稳健。且睡眠纺锤波与δ慢波的相位-幅值耦合强度减弱。基于9项（包括持续时间、潜伏期、振幅、不对称性、周期数等）特征对所有纺锤波事件进行t分布随机邻域嵌入（t-SNE）降维和无监督聚类分析，并进行概率密度分布计算，最终在对照组和CSDS组小鼠中识别出7类纺锤波亚型，各亚型的概率密度分布总体存在分离。二次聚类显示，CSDS组与对照组睡眠纺锤波发生明显分离。为每组重建了群体典型纺锤波。应激小鼠的纺锤波表现出更高的振幅、更短的持续时间及更强的不对称性（图2）。 

图2. CSDS后小鼠睡眠纺锤波的特征改变

为探究上述睡眠异常的神经活动基础，团队在DAT-Cre小鼠（多巴胺能神经元特异性表达Cre重组酶）VTA区注射腺相关病毒AAV-DIO-ChR2并植入光电极，在体记录VTA^DA神经元的放电活动。结果显示，CSDS后VTA^DA神经元放电频率升高，且在NREMs期簇状放电指数显著增强。时间相关性分析表明，VTA^DA神经元的高频放电（尤其是簇状放电事件）与纺锤波活动呈负向关系（图3）。 

图3 CSDS诱导的VTA^DA神经元异常放电是异常睡眠纺锤波的原因

进一步，团队利用顺行与逆行病毒示踪、光纤记录、在体双光子成像及化学遗传学等技术，锁定VTA^DA-mPFC环路为应激干扰睡眠的核心通路。病毒示踪显示，VTA^DA神经元主要与mPFC谷氨酸能兴奋性神经元形成突触连接。光纤记录发现，应激攻击期间，mPFC多巴胺水平升高。为明确VTA^DA神经元放电模式对mPFC末梢多巴胺释放效率的影响，作者向Vglut2-Cre小鼠（谷氨酸能神经元特异性表达Cre重组酶）的VTA注射光遗传激活病毒AAV-TH-ChR2或对照病毒，并向mPFC注射多巴胺探针病毒AAV-DIO-DA3h。采用蓝光分别给予Tonic和Burst模式刺激激活VTA^DA神经元，结果Burst激活VTA^DA神经元比Tonic激活引起mPFC更高水平的多巴胺释放。神经递质组学结果进一步表明CSDS后小鼠mPFC区多巴胺水平增加（图4）。 

图4. 不同模式光激活VTA^DA神经元及CSDS后mPFC的多巴胺释放

为进一步探究mPFC多巴胺波动对睡眠纺锤波的影响，团队采用微型双光子成像结合脑电记录，进行mPFC多巴胺动态信号监测。结果发现，CSDS造模后，NREMs期间多巴胺瞬变事件频率、持续时间及峰值幅度均显著增加。NREMs期间，多巴胺瞬态的ΔF/F值及其峰值密度与同时期的睡眠纺锤波密度呈负相关。这些结果表明，NREMs期间，mPFC多巴胺瞬态水平与纺锤波活动呈负向关系（图5）。 

图5. 升高的多巴胺活动中断了CSDS后睡眠纺锤波的连续产生

总结

该研究首次完整绘制了“慢性应激→VTA^DA神经元Tonic-to-Burst放电模式转变→VTA-mPFC环路过度激活→mPFC多巴胺过量释放→睡眠纺锤波连续性生成受限→NREMs碎片化”的因果图谱。研究突破了以往仅描述睡眠与应激相关性的局限，从放电模式编码、环路投射和离子通道三个维度，系统阐明了应激性睡眠障碍的神经机制。该研究不仅为理解应激相关睡眠障碍提供了全新的环路与放电模式模型，还明确提出了超极化激活环核苷酸门控（HCN）通道和多巴胺1型/2型受体（D1R/D2R）可作为潜在干预靶点，为临床治疗应激性失眠和睡眠质量下降提供了潜在干预策略。

图6. CSDS下VTA-mPFC多巴胺能环路介导睡眠纺锤波异常与睡眠碎片化的机制示意图

空军军医大学西京医院董海龙教授、赵广超副教授为本文的共同通讯作者，李瑞博士、张欣欣助理研究员、李健楠博士后为本文的共同第一作者。该研究获得国家自然科学基金项目、国家科技重大专项青年科学家项目、中国科协青年人才托举工程项目、西京创新研究院联合项目的资助。

本文使用的来自枢密科技的病毒产品，列表如下：

全新减毒版RV-CVS

（Reardon TR, et al. Neuron. 2016.）

枢密科技可提供RV-CVS株及SAD-B19株病毒包装服务。RV-CVS株标记特征：更低的神经毒性，更轻微的神经损伤，更高效的标记效率；感染时间延长至一个月；可结合光遗传、钙成像、Cre、Flp等技术实现脑网络特异性功能研究及基因表达调控。