高盐摄入是慢性非传染性疾病（尤其是心血管疾病）的主要饮食危险因素，在全球范围内，超过一半的饮食相关死亡都与高盐摄入有关。尽管世界卫生组织建议每日食盐摄入量应低于5克，但全球大多数人群的日均食盐消耗量仍超过10克。此外，过去20年间，尽管采取了多项减盐策略，人均每日盐摄入量却始终未发生改变。高盐摄入会导致离子稳态失衡、交感神经与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活、胰岛素抵抗等一系列病理生理变化，进而对心脏、大脑、肾脏、血管等多个器官造成损伤。因此，明确高盐摄入如何引发这些健康问题并开发有效的治疗方案，已成为当务之急。

组织内的过量盐分通过渗透压依赖的方式，促使促炎性免疫细胞富集。同时，高盐摄入还会直接导致肠道菌群失衡。肝脏作为营养物质进入血液的第一道屏障，其大部分血液供应来自肠道门静脉，而门静脉中富含细菌产物、环境毒素及食物抗原。受损的肝细胞会释放多种促炎细胞因子和趋化因子，激活肝脏内的驻留免疫细胞和浸润免疫细胞。肝脂肪变性与C反应蛋白水平升高（心血管不良结局的可靠预测指标）之间存在独立关联，这一事实凸显了肝脏在全身性炎症中所起的关键作用。此外，高盐摄入与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及晚期肝纤维化风险增加独立相关。值得注意的是，作为心血管疾病的潜在独立危险因素，患有NAFLD个体发生10年心血管事件的风险更高。NAFLD可能通过引发全身性炎症、诱导胰岛素抵抗、增加氧化应激等方式促进高血压的发生，这与高盐的作用极为相似。然而，高盐诱导的NAFLD是否是心血管疾病发生发展的病理因素，目前尚不明确。

多种饮食和代谢因素（包括高糖、高脂以及盐介导的血管紧张素Ⅱ变化）导致的靶器官损伤，存在一种被称为“代谢记忆”的现象，即这些因素去除后，损伤仍持续存在。糖尿病肾病中代谢记忆机制的研究表明，炎症、氧化应激和表观遗传修饰是其主要成因。其中，活性氧（ROS）生成增加通过调控促炎基因启动子上的组蛋白表观遗传修饰，在糖尿病并发症中发挥核心作用，可导致低度慢性炎症状态。作为ROS的主要来源，线粒体功能障碍不仅会降低氧化呼吸链活性，导致肝脏脂肪沉积，还会触发先天免疫反应，从而促进NAFLD的发生。SIRT3（sirtuin 3）是抑制线粒体中ROS生成的主要去乙酰化酶，敲除小鼠SIRT3通过诱导多种线粒体蛋白的高乙酰化，导致脂肪肝和代谢综合征。但SIRT3是否参与盐诱导的肝脏炎症记忆，仍有待研究。

陆军军医大学陆军特色医学中心（大坪医院）祝之明主任医师课题组在Circulation期刊（IF=29.69）发表题为“Salt-Induced Hepatic Inflammatory Memory Contributes to Cardiovascular Damage Through Epigenetic Modulation of SIRT3”研究论文。该研究旨在探讨高盐饮食（HSD）诱导的肝脂肪变性是否是心血管损伤的主要原因，及其潜在机制。研究发现，肝脏中SIRT3表达降低是盐诱导的肝脏炎症和脂肪变性的重要介导因子。HSD通过表观遗传修饰机制抑制SIRT3的转录，导致肝脏炎症持续存在。值得注意的是，利用腺相关病毒8型（AAV8）载体在肝脏中过表达SIRT3有效缓解了小鼠持续性肝损伤的进展，从而对抗盐诱导的心血管损伤。综上所述，该研究结果表明，通过抑制肝脏慢性持续性炎症状态，有望为盐诱导的心血管损伤提供一种有效的治疗方法。

1.盐诱导的肝脏炎症和高血压在高盐摄入停止后仍持续存在

小鼠的干预过程和分组情况如图所示。三组小鼠的体重和食物摄入量无显著差异。高盐饮食（8%盐，HSD）显著升高收缩压，但不影响心率（HR）；同时，心脏功能明显受损，表现为射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）降低。此外，高盐摄入还显著提高了血清中促炎标志物（肿瘤坏死因子TNF、IL-6、IL-17、C-C基序趋化因子配体2/CCL2C-X-C基序趋化因子配体10/CXCL10及C反应蛋白/CRP）的水平。HSD使血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）浓度（酶活）升高，并导致AST与ALT的比值上升。相应地，HSD喂养的小鼠肝重与体重的比值也更高。令人惊讶的是，停止高盐摄入后，全身性炎症和肝损伤均未恢复至正常水平，这表明存在持续性肝损伤。同样，盐诱导的高血压和心脏功能障碍在高盐摄入停止后仍较严重。此外，HSD还刺激了肝脏中的脂质蓄积、脂肪变性和纤维化，并使甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和非酯化脂肪酸（NEFA）水平升高；HSD喂养的小鼠肝脏内有更多的中性粒细胞和巨噬细胞浸润。然而，改用正常盐饮食（0.4%盐，NSD）仍无法缓解这些肝脏病理变化。HSD导致炎症和纤维化相关基因的表达显著增加，而停止高盐摄入并未影响这些基因的表达。这些结果表明，高盐诱导的肝损伤具有“记忆”特征。

图1.盐诱导的炎症记忆存在于小鼠肝脏中，并促进心血管损伤

2.肝脏特异性过表达SIRT3可抑制盐诱导的肝脏炎症记忆及心血管损伤

线粒体功能障碍是导致肝脏炎症的重要因素。因此，研究人员检测了小鼠肝组织中的线粒体活性。结果显示，HSD显著降低了肝组织线粒体中复合体Ⅰ的氧化磷酸化活性以及复合体Ⅰ和Ⅳ的电子传递能力，且这些变化在停止高盐摄入后仍持续存在。由于SIRT3是一种关键的线粒体去乙酰化酶，研究者检测了其在肝脏中的表达水平。与细胞核中的SIRT1和线粒体中的SIRT4相比，HSD显著抑制了肝脏中SIRT3的表达，即使在停止高盐摄入后也是如此。短期HSD使SIRT3的表达升高，但长期HSD干预后其表达降低。因此，为探究SIRT3在记忆现象中的重要性，作者在HSD喂养的小鼠改用NSD之前，给其尾静脉注射了AAV8-TBG-SIRT3或对照病毒。在SIRT3敲除（SIRT3-/-）小鼠中验证了SIRT3在肝脏中表达的特异性。结果显示，除肝重与体重的比值降低外，注射AAV8-TBG-SIRT3的小鼠AST水平和促炎细胞因子水平也显著降低。此外，在停止高盐摄入后，SIRT3过表达显著减轻了肝细胞脂肪变性、脂质蓄积、纤维化以及炎症细胞浸润。SIRT3过表达还显著抑制了促炎基因的表达。因此，肝脏中的记忆现象可能与SIRT3的持续低表达有关。

出乎意料的是，停止高盐摄入后，AAV介导的肝脏中SIRT3过表达不仅显著降低了盐诱导的高血压，还拮抗了心脏功能障碍，这表明肝脏中SIRT3的低表达也是盐诱导心血管损伤的重要原因。

图2.肝脏中过表达SIRT3可拮抗停止高盐摄入后持续的炎症反应和心血管损伤

3.肝脏中SIRT3的持续减少导致盐诱导的炎症记忆

接下来，研究人员使用SIRT3-/-小鼠模拟SIRT3表达降低的状态。通过RNA测序，观察到HSD和SIRT3敲除共同上调的基因富集于免疫系统，包括TNF、CCL2等。在NSD喂养状态下，SIRT3敲除对肝重与体重的比值无影响，但进一步加剧HSD诱导的该指标升高。在SIRT3-/-小鼠中，HSD诱导的肝损伤、组织学改变及炎症细胞浸润也更为严重。此外，SIRT3敲除直接增加了促炎基因的表达，并进一步加剧了HSD对这些细胞因子的促进作用。相应地，SIRT3敲除还加重了盐诱导的高血压和心脏功能障碍。在NSD和HSD组中，SIRT3敲除共同上调的基因仍富集于免疫系统，这表明SIRT3在肝脏炎症中具有直接作用。

为进一步明确SIRT3在肝脏中的作用，研究者利用Cre-loxP系统构建了肝脏特异性SIRT3敲除小鼠，并给予HSD喂养。与预期一致，与同窝的SIRT3flox/flox小鼠相比，肝脏中SIRT3敲除的小鼠也出现了更严重的肝脂肪变性和纤维化，同时伴有血压升高和心脏功能下降。

随后，作者通过给SIRT3-/-小鼠注射AAV8-TBG-SIRT3，评估了SIRT3对HSD诱导的肝脏炎症的保护作用。结果显示，恢复SIRT3的表达显著降低了HSD喂养的SIRT3-/-小鼠的肝重与体重比值。与注射对照载体的小鼠相比，注射AAV8-TBG-SIRT3的SIRT3-/-小鼠的肝脂肪变性、脂质蓄积、纤维化及炎症细胞浸润均显著减轻。基因表达分析还表明，在SIRT3-/-小鼠中过表达SIRT3不仅直接降低了促炎细胞因子的高表达水平，还阻断了HSD对其的促进作用。肝脏中SIRT3的过表达也降低了SIRT3-/-小鼠中盐诱导的收缩压升高。

图3.肝脏中敲除SIRT3会加剧高盐诱导的肝脏炎症和心血管损伤

图4.SIRT3-/-小鼠中过表达SIRT3可减轻HSD诱导的肝脏炎症

4.HSD通过表观遗传方式降低SIRT3的表达

由于DNA甲基化在抑制基因表达中发挥重要作用，作者首先探究了与Sirt3基因相关的DNA甲基化状态，以解释盐负荷下SIRT3持续低表达的原因。尽管HSD确实增加了肝组织的整体DNA甲基化水平，但从全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）数据中，未观察到Sirt3基因启动子区域CpG岛的DNA甲基化发生任何变化。因此，转而研究组蛋白表观遗传修饰，发现HSD显著提高了肝脏中p300的表达水平——p300是组蛋白3赖氨酸27（H3K27）的乙酰转移酶，但其甲基转移酶（Ezh2）的表达未受影响。不过，p300的乙酰转移酶活性并未改变。通过染色质免疫沉淀（ChIP）测序，研究人员确定Sirt3基因启动子区域存在乙酰化H3K27（H3K27ac）峰，且高盐负荷后H3K27ac的富集程度增加。ChIP结果还显示，HSD喂养的小鼠肝组织中，H3K27ac与SIRT3启动子的结合显著增加，同时该位点的三甲基化（H3K27me3）水平降低。这些组蛋白修饰的变化在高盐去除后仍持续存在。此外，探究H3K27ac水平升高是否对高盐的基因表达调控作用至关重要。结果显示，小鼠原代肝细胞停止高盐负荷后，敲低或抑制p300（姜黄素）显著消除了H3K27的高乙酰化，并降低促炎基因的表达水平。同时，Sirt3的低表达也恢复至正常水平。

然而，为何H3K27ac对SIRT3表达的影响与对促炎因子的影响相反？作者重新分析了Sirt3基因的启动子区域，发现其中存在NRF2（核因子E2相关因子2）的结合位点——NRF2是SIRT3的正向调控因子。实验发现，HSD显著抑制了肝组织中NRF2与Sirt3启动子区域的结合，且这种抑制在改用NSD后仍持续存在。重要的是，敲低或抑制p300恢复了高盐导致的NRF2与Sirt3启动子结合水平的降低，这表明H3K27ac水平升高可能降低了NRF2的结合能力。此外，2周的HSD显著刺激了小鼠肝脏中NRF2与SIRT3启动子的结合水平，同时伴随SIRT3的短暂高表达。但随着时间推移，NRF2的结合减少，而H3K27ac逐渐增加，同时SIRT3的表达降低。此外，NRF2的表达依赖于HSD的存在，因为在高盐去除后其表达恢复正常。SIRT3的表达先升高后下降，几乎与其启动子上NRF2的结合水平一致。因此，这些结果表明，H3K27ac对NRF2结合的抑制作用，是高盐去除后SIRT3表达持续降低的主要原因。

图5.H3K27ac通过抑制SIRT3启动子上NRF2的结合，降低SIRT3的表达

5.NRF2介导表观遗传修饰对SIRT3表达的调控作用

为明确NRF2在组蛋白乙酰化对SIRT3表达的抑制效应中是否不可或缺，作者用p300抑制剂姜黄素或p300过表达质粒处理来自NRF2+/+和NRF2-/-小鼠的原代肝细胞。结果显示，姜黄素直接刺激SIRT3表达，同时降低炎症分子的表达；而p300过表达则显著降低SIRT3的表达，并升高炎症分子的表达。此外，敲除NRF2直接降低了SIRT3的表达水平，并消除姜黄素或p300过表达质粒的调控作用。然而，这些干预对促炎细胞因子编码基因的调控作用并未受到NRF2敲除的影响。这些结果表明，NRF2与SIRT3启动子结合的受限，是高盐诱导的组蛋白表观遗传修饰对SIRT3表达产生抑制效应的关键因素。

接下来，为验证NRF2对肝脏SIRT3表达是否不可或缺，研究者给NRF2-/-小鼠喂食HSD 16周。结果显示，NRF2缺失对肝重与体重的比值无明显影响，但进一步加剧HSD对该比值的促进作用。在高盐负荷下，NRF2-/-小鼠还表现出更严重的肝脂肪变性。相应地，HSD喂养的NRF2-/-小鼠肝脏中，促炎细胞因子的表达水平显著升高，同时SIRT3的表达降低。

因此，为证实SIRT3的抑制是否介导了NRF2敲除加剧肝脏炎症的作用，研究人员给NRF2-/-小鼠分别注射了AAV8-TBG-SIRT3、AAV8-TBG-NRF2和对照载体。AAV8-TBG-NRF2在肝脏中的特异性也得到了验证。与AAV8-TBG-NRF2类似，恢复肝脏中SIRT3的表达也显著阻断了NRF2敲除对HSD诱导的肝损伤的促进作用。此外，SIRT3过表达还改善了HSD喂养的NRF2-/-小鼠肝脏中促炎细胞因子编码基因的高表达。相反，在HSD喂养的SIRT3-/-小鼠肝脏中过表达NRF2，发现AAV8-TBG-NRF2无法减轻小鼠的肝脂肪变性和脂质蓄积。两组小鼠的炎症基因表达也无差异。这些结果表明，作为NRF2的下游靶标，SIRT3表达的抑制是NRF2敲除促进肝脏炎症的主要原因，且NRF2的肝脏保护作用需要SIRT3的参与。

图6.肝脏过表达SIRT3可减轻NRF2-/-小鼠的持续性炎症

6.二甲双胍治疗可阻断盐诱导的肝脏炎症记忆及心血管损伤

接下来，作者试图探究何种干预措施可对抗盐诱导的炎症记忆。ChIP测序结果显示，SIRT3敲除主要影响与AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）和胰岛素信号通路相关的基因。由于二甲双胍是已知的AMPK激活剂，且能改善高糖或高脂饮食（HFD）诱导的持续性靶器官损伤。研究人员发现，二甲双胍干预后，降低了小鼠的肝重与体重比值，血清AST/ALT比值和促炎标志物水平也显著降低；减轻了HSD诱导的肝损伤和炎症，还完全阻断了盐记忆现象；HSD引起的持续性高血压和心脏功能障碍显著改善。基因表达分析显示，二甲双胍显著降低了HSD喂养小鼠中与炎症和纤维化相关基因的表达升高，并阻断了高盐去除后这些基因的高表达，同时伴随SIRT3表达升高和AMPK激活。二甲双胍治疗还改善了HSD喂养小鼠肝脏的线粒体功能。ChIP结果表明，二甲双胍几乎完全消除了HSD诱导的H3K27高乙酰化，显著提高了NRF2与SIRT3启动子的结合，同时降低了p300基因的表达水平。此外，二甲双胍还阻断了高盐去除后这些指标的持续状态。这些结果表明，二甲双胍对盐诱导的肝脏炎症记忆具有强效抑制作用。

作者进一步利用AMPKα2-/-小鼠，发现敲除AMPKα2不仅阻断了二甲双胍对HSD诱导的肝脂肪变性的预防作用，还抑制了二甲双胍在高盐去除后对这些特征的改善作用。在AMPKα2-/-小鼠中，二甲双胍对SIRT3表达的促进作用消失，同时伴随AMPK失活。这些结果表明，AMPK是二甲双胍发挥预防作用所必需的，且SIRT3的激活也依赖于AMPK。

图7.二甲双胍抑制盐诱导的炎症记忆和心血管损伤的发生

总结

本研究指出，HSD诱导的肝脂肪变性和炎症会表现出炎症记忆现象，并促成心血管损伤，其中HSD通过表观遗传修饰降低肝脏SIRT3的表达，这一过程起到了关键作用。SIRT3表达水平持续偏低是由于H3K27的过度乙酰化抑制了NRF2与其启动子的结合。此外，二甲双胍通过激活AMPK，对盐诱导的肝脏炎症具有保护作用，这提示在HSD人群中，二甲双胍可能成为一种颇具前景的预防心血管损伤的干预手段。

图8.HSD通过肝脏炎症记忆促成心血管损伤模式图

该研究获得国家自然科学基金(项目编号：31430042、31871199、82022006、81721001和81873657)、国家重点研发计划(项目编号：2018YFA0800601)等项目的资助。

本文使用的病毒产品，列表如下：

上述病毒产品我司均可提供，欢迎咨询！

了解产品及服务

请扫码添加客服微信：BrainVTA2020