在人类病毒感染中，1型单纯疱疹病毒（HSV-1）极为常见，全球50%-80%人口血清呈阳性反应。作为疱疹病毒科α亚科成员，这种有包膜的双链DNA病毒可在感觉神经元中建立终身潜伏感染。角膜感染HSV-1可引发疱疹性基质性角膜炎（HSK），这是感染性失明的首要诱因。在角膜上皮发生原发感染并进行增殖性复制后，再经眼神经逆行至三叉神经节（TG）形成终身潜伏库，免疫抑制等情况下可被激活，导致疾病复发和加重。传统一线药物阿昔洛韦（ACV）及其类似物，均以病毒DNA聚合酶为靶点，但在免疫低下或长期用药人群中易出现耐药性。其他潜在策略（如抑制病毒解旋酶-引物酶复合物的小分子药物、抗体及肽类）尚处于研发阶段，即便有报道称TANK（TRAF家族成员相关的NF-κB激活因子）结合激酶1抑制剂BX795能在体内阻断HSV-1感染，但以上策略均无法清除已存在的病毒及调控TG潜伏库，难以预防复发。

CRISPR技术因直接编辑基因组的特性，在遗传病治疗中已进入临床试验，在感染性疾病领域也展现出潜在治疗价值，如Dash等人发现将抗病毒前药物与CRISPR联合使用可清除感染1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的人源化小鼠体内潜伏感染储存库中的病毒。但将CRISPR递送至感染部位（尤其是病毒储存库）仍面临挑战，此前研究利用改良腺相关病毒（AAV）递送靶向HSV基因组的归巢核酸内切酶，实现了对潜伏病毒基因组的可检测清除，但CRISPR的抗HSV活性仍仅限于体外证实，此前尚未有研究显示其在体内对HSK的治疗效果。

上海交通大学系统生物医学研究院蔡宇伽研究员和复旦大学附属眼耳鼻喉科医院洪佳旭副主任医师合作在Nature Biotechnology期刊上发表了题为“Targeting herpes simplex virus with CRISPR-Cas9 cures herpetic stromal keratitis in mice”的研究论文，开发了一种HSV-1清除慢病毒样颗粒HELP，该颗粒可同时递送SpCas9（由RNA引导的DNA内切酶）mRNA和靶向HSV-1必需基因（UL8/UL29）的向导RNA（gRNA）。研究证实，HELP在三种小鼠HSK模型中均可有效阻断HSV-1复制并阻止HSK的发生，可通过从角膜向TG的逆行转运清除病毒储存库。此外，全基因组测序结果显示，其在人源角膜中可抑制病毒复制且无脱靶效应。证实HELP在治疗难治性HSK方面具有潜在的临床应用价值。

枢密科技研发团队凭借着深厚的技术积累，已熟练掌握多种前沿基因编辑技术，可提供CRISPR/Cas9基因编辑、碱基编辑（Base editor，BE）、先导编辑（Prime editor，PE）、PASTE技术、CRISPRa/CRISPRi技术以及表观遗传编辑技术等相关服务，为您的科学研究提供强大支持！详情见文末~

1、HELP可在体外阻断HSV-1复制

首先，研究团队设计了一个gRNA表达盒，可同时靶向HSV-1的两个必需基因UL8和UL29（参与病毒复制与DNA包装），并通过特定的结合机制，将其与SpCas9 mRNA共同包装到VSV-G（水疱性口炎病毒糖蛋白）假型化慢病毒颗粒中，形成携带mRNA的慢病毒样颗粒（mLP），命名为HELP（HSV-1-Erasing Lentiviral Particles）。在病毒组装过程中，慢病毒Gag/GagPol多蛋白（病毒颗粒组装与复制的核心前体蛋白）N端的噬菌体来源MS2外壳蛋白会特异性识别并结合含pac位点（MS2外壳蛋白的天然结合位点）的SpCas9 mRNA，将其共同包装到慢病毒颗粒中；而gRNA表达盒经逆转录后以环状游离DNA形式存在，不会整合到宿主细胞的染色体上。团队通过将6种质粒共转染到293T细胞中，再经超离心收集，成功制备出HELP，同时还制备了带有单一gRNA表达盒的mLP作为对照，分别靶向UL8、UL29或scramble序列（非靶向gRNA）。为验证HELP对HSV-1的抑制作用，团队将这些mLP转导293T细胞24小时后，用HSV-1-GFP感染细胞，并于感染后1天和2天收集上清检测病毒产量，发现所有靶向病毒基因的mLP均有抑制作用，其中HELP（共靶向UL8/UL29）效果最显著，其Cas9 mRNA平均拷贝数为3.5。剂量反应实验显示，HELP的病毒抑制作用随剂量升高而增强，在p24（慢病毒颗粒浓度标志蛋白）为400 ng时达饱和，故后续实验均选用HELP。

进一步研究发现，即使在干扰素α/β受体亚基2（IFNAR2，Ⅰ型干扰素受体的关键亚基）敲除的HaCaT细胞中，HELP仍能显著抑制HSV-1复制。另外对UL8和UL29基因座的分析显示，UL8的插入缺失（indel）频率平均约为40%，而UL29的indel率相对较低（仅为7%），但当以含UL8和UL29序列的质粒为靶标时，UL29 gRNA的indel率更高，这可能是因为UL29突变会导致病毒无法复制，才使其indel率在病毒感染的细胞中被低估。此外，研究人员发现HELP不会引发先天免疫感应，而不同HSV-1毒株在感染复数（MOI）为1时均能被THP-1来源的巨噬细胞感应，并诱导适度但显著的干扰素反应。以上结果共同表明，HELP对HSV-1的抑制作用源于对病毒DNA的直接破坏，而非通过激活依赖Ⅰ型干扰素的先天免疫反应实现。

最后，研究人员进一步探究了HELP在疾病相关细胞模型中的作用：鉴于角膜基质与角膜炎复发密切相关，且其富含来自HSV-1潜伏的TG神经干，他们在小鼠原代角膜基质细胞中验证发现，无论感染后24小时还是48小时及感染复数高低，HELP均能有效抑制HSV-1-GFP表达和病毒复制，而scramble对照组无保护作用，这进一步证实了HELP在体外对HSV-1的阻断效果可延伸至与疾病直接相关的原代细胞中。

图1. HELP在体外阻断HSV-1复制

图2. HELP的抗病毒活性及Cas9 mRNA拷贝数

图3. 先天免疫刺激物对HSV-1-GFP复制的抑制

图4. HELP及不同HSV-1毒株在THP-1衍生巨噬细胞中诱导的先天免疫反应

2、HELP在预防模型中可阻断HSV-1对角膜和神经元的感染

团队首先通过小鼠角膜感染实验明确了HSV-1的发病阈值，即仅当HSV-1载量超过2×10⁴空斑形成单位（p.f.u.）时，小鼠才会出现生存率下降、体重减轻及角膜炎症状，提示将病毒载量降低到这一阈值水平以下即可实现对病毒的有效控制。团队进一步通过共聚焦成像明确了HSV-1在HSK模型中的感染动力学，发现从感染后12小时到8天，病毒逐渐从角膜基质表层向深层扩散。随后按照图5a的实验流程进行实验，在小鼠感染17syn⁺（HSV-1的一种毒株）前1天，通过基质内注射将HELP施用于角膜（预防模型）。深度测序结果显示，HELP诱导UL8和UL29基因座的indel率分别约为7%和5%，且均未检测到脱靶位点，同时Cas9在体内外的表达仅持续3天，这有助于降低脱靶风险。接下来团队通过共聚焦成像评估了小鼠角膜中HSV-1的复制和HELP的分布，结果显示：用病毒衣壳蛋白VP5标记HSV-1、GFP标记HELP分布时，mock处理（PBS处理）组和scramble对照组的小鼠角膜基质中，HSV-1均活跃复制；而HELP处理后，角膜中几乎检测不到HSV-1，且HELP均匀分布于角膜的上皮层、基质层及内皮层。

为评估HELP处理是否能阻断HSV-1从角膜上皮向周围和中枢神经系统的传播，团队检测了小鼠眼睛、TG和脑组织样本中HSV-1基因组拷贝数和感染性病毒，发现HELP处理后这些组织中的病毒载量均显著降低，对全脑和TG的共聚焦成像结果与上述检测一致。此外，为评估HELP的安全性，团队检测了HELP在小鼠体内的分布，发现HELP主要分布在眼部，未在生殖器官等其他器官中检出，虽注射于角膜，但在TG中也检测到了HELP，支持其可经角膜神经末梢逆行递送至TG神经元胞体的观点，TG的共聚焦成像也进一步证实了这一结论。综上，HELP在预防模型中可阻断HSV-1感染角膜与神经元，降低眼部、TG及脑组织病毒载量，且主要局限于眼部，兼具靶向性与安全性。

图5. HELP在预防模型中阻断HSV-1对角膜和神经元的感染

图6. HSV-1角膜感染时间进程及小鼠角膜基质内注射

图7. HELP递送的Cas9存活期蛋白质免疫印迹（WB）分析及HELP全身组织分布

3、HELP在预防模型中抑制HSV-1相关疾病病理

为明确疾病进展及疗效，研究人员对急性眼疱疹感染的临床体征进行了监测，并采用盲法对其进行评分。实验流程如图8a，结果显示，HELP处理的小鼠未出现任何疾病进展，而mock和scramble gRNA处理的小鼠则出现了严重的眼部感染体征。此外，组织学染色表明，mock和scramble gRNA处理的小鼠眼睛呈现出基质结构不规则、角膜厚度增加等急性感染典型特征，而HELP处理组则无这些现象。进一步研究发现，HSV-1感染会诱导角膜产生显著的Ⅰ型干扰素反应，而HELP转导不会；同时，HSV-1感染会诱导角膜中IL-6、CCL2和CXCL10等炎症分子的表达，HELP处理可阻断这种诱导。

免疫组织化学结果显示，HSV-1感染使mock和scramble gRNA处理组小鼠角膜基质中出现CD4⁺、CD8⁺ T细胞浸润，而HELP处理可阻止此类T细胞浸润；此外，非治疗组（mock和scramble对照）可见CD11b⁺髓系细胞及F4/80⁺巨噬细胞，而HELP处理组和未感染对照（NC）组中未观察到。另外，HSV-1感染后未治疗小鼠的角膜上皮和基质中PD-L1（程序性死亡配体1）表达上调，局部PD-L1的表达增加可能抑制免疫细胞对病毒的清除，这也凸显了CRISPR不依赖免疫细胞清除而是直接靶向DNA的重要性。

为评估分泌型病毒的存在，团队在感染后每隔一天对小鼠眼拭子（眼部取样）的病毒滴度进行测定，结果显示，HELP处理显著减少了小鼠睛中病毒的存在；体重记录显示，HELP处理的小鼠未出现体重减轻，而mock和scramble对照处理的小鼠则有明显体重下降；值得注意的是，HELP处理组的所有小鼠均存活且在3个月的随访中未出现HSK复发。综上，在预防性模型中，HELP能够有效抑制HSV-1引发的疾病病理进程。

图8. HELP在预防模型中抑制HSV-1相关疾病病理

图9. 体内HELP和HSV-1感染诱导的先天免疫反应

图10. HSV-1 17syn⁺感染后角膜中表达的炎性细胞因子

图11. 体内角膜中的免疫细胞浸润及PD-L1表达

图12. 预防模型中HELP处理小鼠的长期随访

4、预防模型中HELP处理后的眼部健康

随后，团队采用了多种临床相关指标全面评估了HELP处理后小鼠的角膜健康状况：荧光素钠染色（可染色受损的上皮细胞）显示，HELP处理的角膜受到显著保护，免受HSV-1感染；酚红棉线试验表明，HELP处理能有效缓解泪液分泌减少导致的角膜干燥；触觉测量计（Esthesiometer）测量（测量角膜的机械感觉功能）结果显示，HELP处理组角膜的机械感觉功能得以保留；全视野视网膜电图（ERG）结果显示，在3 cd・s/m²闪光刺激下，HELP处理组小鼠的a波（光感受器反应）和b波（视锥与视杆系统反应）振幅显著高于mock处理组，且接近未感染对照眼水平，表明其视觉功能得到较好保留，而mock处理组的a波和b波振幅显著降低，提示视觉功能存在缺陷。这些结果证实，小鼠实验性HSK会导致严重的视觉功能缺陷，这可能是由于角膜透明度降低、视网膜接收的光刺激强度减弱所致，而非视网膜直接损伤的结果，HELP的处理可预防此类视觉功能缺陷。

新生血管形成是HSK的典型特征，因此团队通过全标本FITC（异硫氰酸荧光素）标记葡聚糖染色评估了小鼠角膜新生血管程度，结果显示HSV-1感染诱导的角膜新生血管可被HELP抑制。此外，在免疫原性方面，角膜基质内注射HELP未在血液中诱导出显著的Cas9特异性IgG（免疫球蛋白G）：HELP处理组和scramble对照组小鼠的Cas9特异性IgG水平与mock处理组相比均无显著升高，当通过足垫注射HELP时，血清中抗Cas9 IgG水平显著升高，表明局部HELP递送可显著规避免疫原性风险。另外，HSV-1眼部感染会诱导高滴度的抗HSV-1中和抗体，而HELP处理后则无此类抗体。综上，HELP处理可显著减轻HSV-1眼部感染期间的疾病严重程度。

图13. 预防模型中HELP处理后的眼部健康状况

图14. 小鼠视网膜的组织学分析、血清中的Cas9特异性IgG水平及HSV-1感染诱导产生的中和抗体

5、HELP在治疗模型与复发模型中对HSK的治疗效果

为更好地模拟HSK的治疗过程，研究团队先给小鼠眼睛接种2×10⁶ p.f.u.的HSV-1，感染2天后用HELP或ACV（阳性对照）处理（角膜基质内注射）小鼠。结果显示，与mock处理组小鼠相比，ACV和HELP处理均能抑制眼睑病变并减少泪拭子中感染性HSV-1的分泌，但只有HELP能显著降低眼睛中感染性HSV-1的水平，这表明CRISPR在清除病毒方面具有独特优势。另外，mock处理组的所有小鼠均死亡，而HELP和ACV处理均显著提高了小鼠存活率，且HELP的效果优于ACV。随后，团队将HSV-1剂量降至每只眼5×10⁴ p.f.u.，并在感染后1天进行注射处理，结果显示mock处理小鼠角膜在感染后14天出现HSK症状，而HELP和ACV处理均能阻止疾病进展，且二者均能维持角膜的机械感觉功能，mock处理组则未能维持。此外，通过荧光染色结合共聚焦显微镜分析显示，mock处理小鼠出现β-Ⅲ-微管蛋白缺失和胶原结合肽增多（表明角膜结构与功能损伤），而HELP和ACV处理组则无这些现象。

在病毒分布方面，HELP阻断HSV-1在角膜中复制的效率优于ACV，且能通过逆行转运将TG中的HSV-1病毒载量降至几乎检测不到的水平，而ACV无法调控TG中的病毒储存库。为进一步证实HELP可调控HSV病毒库，团队采用了复发性HSK模型：小鼠眼部先感染HSV-1以建立潜伏感染，再行HELP处理。HSV-1接种60天后，对存活小鼠眼部行UV-B（紫外线-B）照射以激活复发，随后角膜基质内注射HELP，7天后定量分析眼部HSV-1基因组。结果显示，HELP显著降低眼部病毒载量（这些病毒经顺行运输从TG迁移而来），TG中HSV-1水平亦显著降低。综上，HELP能有效抑制疾病进展、减少病毒载量、调控病毒储存库并改善角膜功能，在HSK治疗模型和复发模型中展现出显著的抗病毒效果。

图15. HELP在治疗模型与复发模型中对HSK的治疗效果

6、HELP在人角膜组织培养中对HSV-1的清除作用

最后，研究人员探究了HELP在人角膜中的抗病毒潜力。团队将人角膜平均分成两半，分别注射15 μL HELP（相当于1.5 μg p24）或PBS，然后进行共聚焦成像。结果显示与mock处理的对照角膜相比，HELP在角膜基质中均匀分布，且能有效抑制HSV-1（17syn⁺）的复制，表现为VP5表达减少。对另一供体角膜的检测显示，HELP处理显著降低了HSV-1基因组的数量和病毒滴度，此外，WB也几乎检测不到VP5蛋白。

为评估HELP的安全性，团队对一个均匀分成两半、分别注射HELP和PBS的人角膜进行了全基因组测序（WGS）。结果显示，HELP处理组检测到4,123,284个单核苷酸变异（SNVs）和1,328,314个indels，mock处理组检测到3,726,678个SNVs和981,253个indels。经Cas-OFFinder（预测基因编辑脱靶位点的生物信息学工具）预测的707个脱靶点及mock处理组角膜的WGS序列对上述变异进行筛选后，仅发现31个SNVs和7个indel突变，且均不位于编码区，表明HELP处理的人角膜中不存在具有功能意义的脱靶位点。

图16. HELP在人角膜组织培养中对HSV-1的清除作用

图17. WGS数据的整体质量

图18. 对照组角膜组织块在WGS水平的SNVs及indel突变鉴定

总结

综上，本研究开发的HELP系统，通过基于mRNA的CRISPR递送进行瞬时基因编辑，在体内对HSK产生治疗效果，并阻断人角膜中HSV-1的复制。其核心优势在于，借助VSV-G胞膜蛋白的介导实现神经逆行转运，从而清除TG中的病毒储存库，从根源上抑制HSK的复发，这对解决HSK反复复发的临床难题意义重大。

HELP采用临床常规的角膜基质内注射给药，该方式已广泛应用于相关眼病治疗，临床转化可行性高。此外，实验通过多种评估手段证实，经HELP治疗后角膜状态良好，且能减少炎症细胞浸润，进一步验证了其安全性与有效性。与AAV递送的归巢内切酶相比，HELP突破载体大小限制，可高效共递送SpCas9与gRNA，病毒清除效率更高；同时，HELP基于mRNA的特性，且不含Cas9启动子，避免了在非分裂神经元中的长期存续，安全性更优。HELP靶向病毒基因组而非人类基因组的设计有望加速临床转化，也为其他病毒及遗传病的CRISPR治疗提供了重要参考。

通讯作者介绍

蔡宇伽，上海交通大学研究员、长聘副教授及博士生导师，先后就读于山东大学、中科院、卡洛琳斯卡医学院及奥胡斯大学，研究方向包括：1）利用CRISPR全基因组文库、单细胞测序等系统性工具发现免疫、衰老的新靶点和生物学新机制；2）发明新型基因编辑工具、新型递送载体、新型免疫治疗技术，实现遗传疾病、肿瘤、病毒感染等难治性重大疾病的治疗；3）将原创性的发现和发明用于临床治疗，开发全球意义的first in class药物。相关研究成果发表于Nature、Nature Nanotechnology、Nature Biotechnology、Nature Biomedical Engineering、Gene Therapy等国际学术期刊。

我司可提供包括CRISPR/Cas9基因编辑在内的多种基因编辑递送工具，列表如下：

了解产品及服务

请扫码添加客服微信：BrainVTA2020