简介

1992年Manfred Gossen和Hermann Bujard合作进行了开创性研究，开发出Tet-off系统。相关研究成果以“Tight control of gene expression in mammalian cells bytetracycline-responsive promoters”为题发表在PNAS期刊。Tet-on/Tet-off系统是分子生物学和基因工程中最经典、应用最广泛的可诱导基因表达系统之一。该系统源于大肠杆菌转座子Tn10四环素（Tetracycline,Tet）抗性操纵子（TetO），主要由Tet响应元件（TRE，由7个重复的TetO序列组成）、Tet阻遏蛋白（TetR）及其改造蛋白等组成，能在真核细胞（如哺乳动物细胞）中实现精确、可逆、剂量依赖地控制目标基因的开启或关闭。

图1.Tet诱导系统（Navabpour, Shaghayegh et al., Neuroscience and biobehavioral reviews, 2020.）

基本原理

TetR能与TetO特异性结合。当细胞内无Tet时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的抗性基因表达。而当细胞内有Tet时，TetR的构象发生改变，使TetR与TetO分离，从而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。

01 Tet-off系统原理

tTA是由TetR和单纯疱疹病毒VP16蛋白C端的一段转录激活结构域融合而成的蛋白，是四环素阻遏转录激活因子。当不存在多西环素（Doxcycline，Dox）时，tTA和TRE结合，启动下游基因表达；当存在Dox时，tTA的构象发生改变，tTA会从TRE上脱落，从而导致下游基因表达关闭。

02 Tet-on系统原理

反义tTA（rtTA）是由反义TetR（rTetR）和单纯疱疹病毒VP16蛋白C端的一段转录激活结构域融合而成的蛋白，它的表型与tTA相反 。rtTA，只有在四环素存在的情况下激活TRE。当Dox不存在时，rtTA不能结合TRE, 下游基因表达关闭。当存在Dox时，rtTA的构象发生改变，rtTA结合TRE，下游基因表达开启。

关键特性与优势

01 高度严谨：在未诱导状态下（Tet-off有Dox；Tet-on无Dox），背景泄露表达通常非常低。在诱导状态下（Tet-off无Dox；Tet-on有Dox），表达水平可以非常高（接近强组成型启动子）。

02 可逆性：通过添加或撤除Dox，可以反复、快速地开启或关闭基因表达。这对于研究基因功能的动态变化至关重要。

03 剂量依赖性：基因表达的水平可以通过Dox的浓度进行精细调控（在有效浓度范围内，浓度越高，Tet-on诱导越强，Tet-off抑制越强）。

04 快速响应：Dox是小分子，能快速穿过细胞膜（包括血脑屏障）。添加Dox后，基因表达通常在几小时（mRNA）到一两天（蛋白）内发生显著变化；撤除Dox后表达也会相应下降。

05 低细胞毒性：在常用浓度范围内，Dox对大多数细胞类型的毒性很低，适合长期实验和在体研究。

06 广泛适用性：已成功应用于小鼠、大鼠等多种模式生物。

应用场景

1.功能基因研究

1）在特定时间、特定细胞类型或组织中诱导表达某个基因，研究其过表达对细胞表型、信号通路、发育或疾病进程的影响。

2）在转基因动物（如小鼠）中实现时空特异性的基因表达。例如，利用组织特异性启动子驱动rtTA/tTA表达，再通过Dox给药控制仅在特定组织（如肝脏、大脑）和特定时间（如成年期）开启或关闭目标基因。

2.神经科学研究

可与光遗传学、钙成像等技术结合，研究神经系统的功能和机制。如利用Tet-off系统结合光敏蛋白，标记小鼠大脑中与恐惧记忆相关的记忆痕迹细胞，通过光遗传激活这些细胞，研究记忆的编码、存储和提取机制。

客户案例分享

客户文章（IF=8.1）：

Yu YM, Xia SH, Xu Z, Zhao WN, Song L, Pan X, Zhong CC, Wang D, Gao YH, Yang JX, Wu P, Zhang H, An S, Cao JL, Ding HL. An accumbal microcircuit for the transition from acute to chronic pain. Curr Biol. 2025 Apr 21;35(8):1730-1749.e5. doi: 10.1016/j.cub.2025.02.055. Epub 2025 Mar 19. PMID: 40112811.

使用我司病毒：

AAV2/9-cfos-tTA-WPRE-hGH pA

AAV2/9-TRE-tight-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-hGH pA

AAV2/9-TRE3g-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGH polyA

AAV2/9-TRE3g-hChR2(E123T/T159C)-mCherry-WPRE-hGH pA

作者通过tTA-TRE（Tet-Off）系统特异性标记了不同类型急性疼痛（足底注射辣椒素/CAP、坐骨神经慢性压迫性损伤/CCI急性期）激活的伏隔核壳区（NAcS）和核心区（NAcC）神经元，并在急性疼痛消退后重新激活这两种神经元。研究结果表明，尽管急性疼痛可以同时激活NAcS和NAcC神经元，但在疼痛消退后数天，只有NAcS神经元的再激活能够诱发小鼠的疼痛反应。这表明，在机体损伤早期被疼痛激活的NAcS神经元在慢性疼痛的发展过程中发挥重要作用，并可能作为调控疼痛慢性化的一个潜在启动器。

图2.激活急性疼痛标记的NAcS神经元可再次诱发疼痛

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