特发性肺纤维化（IPF）是一种肺部纤维化疾病，其特征为进行性呼吸困难和肺功能受损，自诊断起平均生存期约为3年。该病主要发生于60岁以上人群，被视为一种与年龄相关的疾病，这表明衰老在IPF的发生发展中起着关键作用。IPF是端粒相关疾病最常见的表现之一。端粒被定义为位于染色体末端的特殊DNA-蛋白复合物，可防止染色体降解和基因组不稳定。端粒酶逆转录酶（TERT）能够延长端粒，并与衰老相关。既往研究表明，携带TERT突变的IPF患者通常伴有端粒缩短（作者团队成果）。然而，仅有不到10%的IPF患者携带端粒酶基因突变，绝大多数IPF患者，特别是否认家族史的散发性患者，其端粒酶活性降低且端粒长度缩短，这表明IPF中端粒酶表达和端粒长度的调控机制仍不清楚。

Krüpple样因子（KLFs）是已知的转录因子，调控多种细胞过程。其中，KLF4已被证明是四种将不同类型分化细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）所必需的转录因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC）之一，据报道其主要在胃肠道和上皮细胞中表达。KLF4的功能取决于其相互作用的蛋白和结合位点环境。研究表明，KLF4在肺癌和肺动脉高压中表达降低；KLF4可抑制肾上皮细胞、肝癌细胞和小鼠肺上皮LA-4细胞的上皮-间质转化（EMT）；敲低KLF4促进了TGF-β1（转化生长因子-β1）引发的EMT，这表明KLF4通过抑制TGF-β1介导的EMT在博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化中发挥重要作用。然而，KLF4在肺纤维化肺泡上皮细胞（AECs）中的作用尚未明确。此外，既往研究显示KLF4对端粒酶基因表达的调控有关键影响。如在人胚胎干细胞（hESCs）中敲除KLF4降低了TERT蛋白表达；KLF4通过直接激活其转录来维持hESCs中hTERT表达。但KLF4在人AECs中、肺纤维化进展过程中的功能有待确认。

因此，南京大学医学院附属鼓楼医院代静泓主任医师、王东进主任医师联合南京医科大学附属无锡人民医院陈静瑜教授在Cell Death & Disease期刊发表了题为“KLF4 regulates TERT expression in alveolar epithelial cells in pulmonary fibrosis”的研究论文，作者假设KLF4可能调控AECs中TERT蛋白表达、端粒长度及端粒酶活性。该研究旨在阐明肺纤维化中AECs内TERT蛋白表达的调控机制。研究人员发现，在IPF患者和BLM诱导的小鼠模型的肺组织中，P16、P21及纤维化标志物（α-SMA和I型胶原）显著增加，而KLF4和TERT在AECs中的表达则降低。在体内实验中，研究者构建了由腺相关病毒AAV6载体介导、SP-C启动子（肺泡II型上皮细胞特异性）驱动的KLF4过表达体系。结果显示，在AECs中过表达KLF4能够保护TERT的表达，并抑制BLM诱导的小鼠模型中肺纤维化的发展。在探索TERT调控机制时，作者发现KLF4和TERT在BLM诱导衰老的MLE-12细胞（小鼠肺泡II型上皮细胞，常用的永生化肺上皮细胞系）中均下调。与对照组相比，靶向KLF4的小干扰RNA（siRNA）显著降低了TERT表达并诱导细胞衰老。此外，MLE-12细胞中染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，KLF4能够结合到TERT启动子区域，这提示KLF4可能通过调控AECs中TERT的转录而参与肺纤维化的发病机制。综上所述，本研究确定KLF4可能是一个具有前景的潜在靶点，有助于进一步理解IPF的机制并开发新的治疗策略。

1.IPF肺组织AECs中TERT和KLF4表达降低

既往研究表明，IPF患者的AECs经历了衰老，衰老标志物如P16、P21在这些细胞中高表达。为确定IPF中的衰老标志物和TERT表达，作者获取了12例IPF患者（接受肺移植）和12例肺癌癌旁正常组织的肺组织切片进行Western Blot和qPCR检测。结果显示，IPF肺组织中P16、P21、α-SMA和Collagen-I的表达均显著升高，而TERT表达降低。采用双标免疫荧光染色评估AECs中P21的存在，分析了IPF组和肺癌癌旁正常组肺组织中SP-C（AECs的特异性标志物）和P21的表达水平。如下图所示，在IPF组检测到双染细胞，但在正常组中观察到极少量的双阳性细胞。类似地，免疫荧光也证实IPF组AECs中TERT表达下调。此外，与TERT表达一致，研究人员Western Blot和qPCR检测发现KLF4在IPF肺组织中的表达显著降低。免疫荧光染色也显示，IPF中AECs的KLF4表达降低。这表明，KLF4水平的降低可能在IPF患者AECs的衰老过程中扮演核心角色。

图1.KLF4和TERT在人IPF肺组织AECs中表达下调

2.BLM诱导的小鼠肺组织中TERT和KLF4表达降低

随后，研究人员通过随机数字表法将老年（6月龄）小鼠随机分为两组（对照组和BLM组），实验组气管滴注BLM。正如预期，BLM处理14天后的小鼠肺切片在苏木精-伊红染色（H&E）和Masson染色中显示出明显的肺泡损伤、结构破坏及肺泡实质中纤维化胶原的积聚。免疫组化显示，与对照组相比，BLM诱导的小鼠肺组织中衰老标志物P16、P21和P53的表达显著增加。研究者还发现，纤维化肺组织的上皮区域出现了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性染色（衰老细胞被标记为蓝色）增加，这在正常肺组织中几乎看不到。与人类肺组织的结果一致，qPCR和蛋白免疫印迹证实，在BLM诱导的肺纤维化组织中，P16、P21的表达升高，而TERT的表达降低。同时，蛋白免疫印迹也表明，纤维化肺组织中KLF4表达下调，而纤维化标志物（α-SMA和Collagen-I）表达上调。免疫荧光染色显示，在BLM诱导的肺纤维化组织中AECs的TERT表达降低。此外，端粒长度检测也表明，BLM诱导的纤维化肺组织具有缩短的端粒长度。这些结果表明，BLM诱导的肺纤维化模型小鼠的AECs发生了衰老，且KLF4和TERT的表达显著降低。

图2.BLM诱导的小鼠肺组织中TERT和KLF4表达降低

3.过表达KLF4减轻BLM诱导的肺纤维化模型中的衰老

为研究KLF4在体内对肺纤维化的影响，作者构建了由AAV6载体介导的、带有SP-C启动子的KLF4过表达系统，该系统可特异性靶向AECs并提高AECs中KLF4的表达水平。免疫荧光染色结果显示，在KLF4过表达组中，观察到AECs中KLF4的表达显著上调，表明AAV6-SP-C-KLF4载体过表达效率高。研究人员在8周龄小鼠体内递送过表达载体后进行了BLM气管滴注给药，未作处理的同窝小鼠作为对照组，仅BLM处理作为另一实验组。H&E、Masson染色结果显示，BLM组小鼠出现了严重的肺纤维化。而BLM+KLF4-OE组小鼠肺纤维化的严重程度和胶原纤维积聚均有所减轻。β-gal染色结果证明，相较于BLM组，BLM+KLF4-OE组衰老细胞数量减少。免疫荧光显示，BLM+KLF4-OE组小鼠AECs中TERT的表达显著高于BLM组。此外，BLM+OE-KLF4组的端粒长度显著长于BLM组，表明KLF4在肺纤维化中具有保护端粒长度的作用。另外，蛋白免疫印迹证实，与对照组比较，BLM组P21表达上调，而TERT表达下调。另一方面，与BLM组相比，BLM+KLF4-OE组P21的上调受到抑制，TERT的下调得到缓解。同时BLM+KLF4-OE组纤维化标志物（α-SMA和Collagen-I）的表达降低。这些结果表明KLF4对肺纤维化发挥保护作用。

图3.过表达KLF4减轻BLM诱导的肺纤维化模型中的衰老和纤维化

4.敲低KLF4增强AECs的衰老

为进一步确认KLF4在AECs中的作用，研究者在MLE-12细胞（小鼠肺泡II型上皮细胞）中检测了KLF4对TERT和衰老的影响。首先，研究人员在培养基中用10 μg/mL的BLM处理MLE-12细胞12、24、48和72小时。结果显示，处理72小时后，细胞变大、出现空泡，有时表现为多核或巨核形态。β-gal染色显示，BLM增加了衰老细胞的数量。此外，在BLM刺激的细胞中，P21的表达增加而TERT的表达降低（同时KLF4的表达下调）。这些结果表明体外衰老AECs模型已成功构建。

为探究内源性KLF4是否参与AECs中TERT调控，研究人员用KLF4 siRNA或对照siRNA转染了MLE-12细胞。结果显示KLF4 siRNA能有效降低KLF4的mRNA和蛋白水平，表明敲低效果好。研究者还发现，与乱序对照组（scramble group）比较，干扰KLF4显著降低了MLE-12细胞的TERT表达水平和端粒长度（P21表达同步上调）。此外，免疫荧光显示，与BLM+siNC组相比，BLM+siKLF4组细胞核内的TERT表达更低，且在β-gal染色中观察到更多的衰老细胞。这些结果表明，KLF4的表达能够影响TERT的表达，并在TERT的调控中起着至关重要的作用。

图4.敲低KLF4诱导AECs衰老

5.KLF4调控TERT

为进一步探索KLF4在TERT调控中的作用，研究人员在MLE-12细胞中进行了染色质免疫沉淀（ChIP）测序和ChIP-qPCR。ChIP测序结果显示，KLF4能够结合到TERT启动子基序，同时也能结合R端粒酶和TIN2（它们也是端粒相关基因），这表明KLF4可能通过转录水平调控TERT的表达。ChIP-qPCR结果表明，在BLM组、siKLF4组中，KLF4结合的TERT启动子的转录均减少，这表明BLM处理导致的KLF4下调会降低TERT的转录水平，从而减少TERT的蛋白表达。这些结果证明，KLF4在TERT和端粒长度的调控中具有重要作用，其机制很可能是通过作用于TERT启动子。

图5.KLF4调控TERT

总结

本研究发现在IPF患者和BLM诱导的肺纤维化小鼠模型的AECs中，KLF4的表达降低。转录因子KLF4能够通过与TERT启动子结合来保护AECs中TERT的表达和端粒长度，从而减轻BLM诱导的肺纤维化。总的来说，KLF4有望成为一个重要的潜在靶点，有助于深入理解肺纤维化机制并为开发新的治疗策略提供方向。

本研究得到国家自然科学基金(No.82170076、No.81570058)项目、江苏省医学人才项目(No.ZDRCA2016058)资助。

通讯作者介绍：

代静泓，教授，南京大学医学院附属鼓楼医院呼吸与危重症医学科主任医师，博士生导师,行政副主任。中国医师协会呼吸病学分会间质性肺病工作组委员，江苏省医学会呼吸病学分会委员，肺间质病学组副组长，江苏省医师协会呼吸病学分会委员及间质病学组组长，江苏省医学会内科学分会委员，江苏省中西医结合学会委员。江苏省十三五科教强卫工程医学重点人才，六大人才高峰高层次人才。主持国家自然科学基金面上项目及多项省市级课题，以通讯作者、第一作者发表相关SCI论文30余篇。擅长间质性肺病、呼吸系统疑难罕见病、呼吸危重症、肺部肿瘤的诊断与治疗，熟练掌握支气管镜下诊断及治疗技术。

王东进，医学博士，南京大学医学院附属鼓楼医院心脏外科主任医师，医学博士后导师，南大、南医大、协和、南中医、东大、徐医大、江苏大学教授、博硕士生导师，享受国务院政府特殊津贴。现为江苏省大血管疾病诊疗中心主任，南京市心血管病临床医学中心主任，鼓楼医院心血管病中心主任，南京大学心胸血管疾病研究所所长，鼓楼医院心胸外科行政主任。兼任国际微创胸心外科学会委员、中国医药生物技术协会心血管外科技术与工程分会副主委、中国医师协会心血管外科医师分会常委、中国研究型医院学会心脏瓣膜病学专业委员会常委、国家心血管病专家委员会微创心血管外科专业常委、江苏省医学会心血管外科分会主任委员、江苏省医学会心血管外科分会大血管外科学组组长等。已参加各类心血管手术并主刀超万例，其1997年首创的右腋下小切口心脏手术技术在国内外学术界产生广泛影响。荣获中华医学科技奖三等奖、江苏省科学技术奖二等奖、江苏医学科技奖一等奖、华夏医学科技奖三等奖等诸多荣誉，获全国十大最美医生、中国医师协会心血管外科金刀奖、全国卫生系统先进工作者、中国好医生月度人物、感动中国•江苏年度人物、江苏省有突出贡献中青年专家、南京好市民、感动南京年度人物、南京医科大学名医、南京市十大科技之星等诸多荣誉。擅长各类疑难、复杂危重先天性心脏病、心脏瓣膜病、冠心病、心房纤颤、胸主动脉瘤及主动脉夹层等所有心脏大血管疾病的诊治。

陈静瑜，教授、博士生导师，南医大附属无锡市人民医院副院长、胸外科主任，中日友好医院肺移植科主任，江苏省肺移植中心主任，江苏省器官移植重点实验室主任。中华医学会器官移植分会常务委员及心肺移植组副组长，江苏省医学会器官移植分会主任委员，江苏省医学会胸外科分会副主任委员，中国人体器官捐献与移植委员会委员，国家卫计委肺移植数据管理单位负责人，国家卫计委肺移植质控中心主任，中国医院学会器官获取与分配管理工作委员会第一届常务委员。擅长于肺移植手术、胸腔镜手术、肺癌扩大根治、肺癌的综合治疗及ECMO应用。承担国家十一五攻关项目1项，完成卫生部课题1项，江苏省卫生厅课题2项。扶持国家16个省30多家医院开展了肺移植。“肺移植治疗终末期肺病的基础及临床研究”获得中华医学奖二等奖、江苏省科技奖三等奖；2019年“肺移植治疗重症肺动脉高压的基础研究和临床应用”获中华医学科技奖三等奖、江苏医学科技奖二等奖；“肺移植诊疗体系的构建和临床应用推广”获2020年华夏医学科技奖一等奖。

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