简介

大脑中数千亿神经元通过复杂连接构成信息网络，解析神经元间的连接路径是神经科学研究的核心挑战。传统示踪方法难以应对多脑区、多类型神经元形成的复杂突触网络。而单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）凭借天然嗜神经性和跨突触传播特性，成为研究神经环路的有力工具。其中，经基因工程改造的HSV-1型H129株作为顺行跨多级突触示踪工具，可沿神经元轴突的微管系统顺行运输，从胞体向轴突末梢及下游突触后神经元实现多级跨突触精准标记，为解析神经环路的层级连接提供关键技术支撑。

原理

HSV属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，包含HSV-1和HSV-2两种亚型。其基因组为约152 kb的线性双链DNA，由共价连接的长独特区（UL）和短独特区（US）组成，各区段两端均含反向重复序列。病毒感染宿主细胞后，基因组通过反向重复序列同源重组实现环化。HSV基因组中近半数为非必需基因，遗传改造空间大，可将大片段外源基因或多个转基因同时引入病毒基因组。

图1. HSV-1病毒粒子结构、基因组结构及基因表达策略（Everett RD et al., Methods Mol Biol, 2014.）

HSV实现顺行跨突触的核心过程依赖其独特的病毒结构与蛋白功能：病毒衣壳通过gD蛋白特异性结合神经元表面受体（HVEM、nectin-1等），触发衣壳表面的糖蛋白复合物gB/gH/gL介导的膜融合或网格蛋白依赖的内吞进入胞体。病毒基因组释放后，在胞体中利用宿主转录和翻译系统进行复制，通过衣壳或包膜蛋白与驱动蛋白（kinesin-1）结合，借助神经元内的微管系统完成顺行运输。

顺行跨突触的关键步骤：

胞内运输：组装好的病毒核衣壳与kinesin-1家族成员（KIF5A/B/C）结合，沿微管正端（从胞体向轴突末梢）运输；

突触传递：到达轴突末梢后，病毒颗粒通过与突触前膜融合释放至突触间隙，凭借gD等糖蛋白与突触后神经元表面受体结合，启动新一轮感染；

级联标记：若为跨多突触毒株（如H129株），子代病毒可重复上述步骤，持续感染下游神经元，从而实现多级神经环路的顺行标记。

H129株作为HSV-1临床分离株，其天然具备顺向跨突触特性。经基因工程改造去除部分毒性基因、插入荧光蛋白基因后，不仅能标记中枢脑区之间的连接，还可追踪外周与中枢的神经联系，适用于大/小鼠、非人灵长类等多物种的神经输出环路研究，为解析复杂神经信息传导通路提供了高效工具。

1.HSV顺向跨多级突触系统

HSV-1型H129株是具有天然顺向跨突触特性的临床分离株。其核心机制为：病毒感染神经元后，利用宿主细胞转录翻译系统完成基因组复制与衣壳组装，通过驱动蛋白介导的微管运输，沿轴突顺向抵达突触前末梢。随后，病毒通过突触间隙感染下游神经元，启动新一轮复制周期，形成多级跨突触传播。将荧光蛋白基因插入其基因组后能实现顺向跨多级突触标记神经元的示踪效果。

2.HSV顺向跨单级突触系统

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSV-TK）是α疱疹病毒复制过程中的关键酶，其核心功能为催化病毒DNA合成所需的脱氧胸苷酸（dTMP）生成。当HSV-TK基因缺失（HSV-ΔTK）时，病毒虽能通过膜融合侵入神经元并释放基因组，但因dNTP池失衡（特别是dTTP缺乏）导致病毒DNA聚合酶无法完成链延伸，从而阻断病毒基因组复制。通过与表达HSV-TK的腺相关病毒（AAV-TK）联用，仅在AAV-TK感染的注射位点神经元中提供TK酶，支持HSV-ΔTK在这些神经元中完成一次复制周期。产生的子代病毒因缺乏持续TK供应，无法在突触后神经元中复制，从而实现顺向跨单级突触标记。

图2. H129株的示踪病毒基因组结构及顺行示踪示意图（Li D et al., Int J Mol Sci, 2020）

主要应用

1.全脑神经网络架构解析

2.发育与可塑性研究

3.神经疾病机制研究

4.神经损伤与修复评估

5.外周器官与中枢神经系统间联系通路测绘

客户案例分享

1、顺向跨多突触示踪

客户文章（IF=14.7）：Li D, Li YC, Zhu ZY, Zhang FC, Zhao QY, Jiang JH, Shen B, Tang Y, Xu GY. The paraventricular thalamus mediates visceral pain and anxiety-like behaviors via two distinct pathways. Neuron. 2025 May 6:S0896-6273(25)00302-2. doi: 10.1016/j.neuron.2025.04.019. Epub ahead of print. PMID: 40345185.

使用我司病毒：HSV-tdTomato

为探究可能参与结肠内脏痛处理的脑区，研究人员将单纯疱疹病毒HSV-tdTomato注射至小鼠结直肠壁。8天后，首先在结直肠壁观察到tdTomato标记的神经元。进一步全脑成像分析显示，PVT（丘脑室旁核）、LC（蓝斑）和PVH（下丘脑室旁核）等多个脑区出现特异性荧光信号，证实这些核团与结直肠存在解剖学连接。

图3. 小鼠结直肠相关脑区

2、顺向跨单突触示踪

客户文章（IF=14.7）：Huang JY, Jin YX, Dong WY, Zhao W, Cheng PK, Miao JH, Liu A, Wang D, Li J, Zhang Z, Tao W, Zhu X. Intra-somatosensory cortical circuits mediating pain-induced analgesia. Nat Commun. 2025 Feb 21;16(1):1859. doi: 10.1038/s41467-025-57050-y. PMID: 39984470; PMCID: PMC11845469.

使用我司病毒：
rAAV-Ef1α-DIO-EGFP-T2A-TK-WPRE-hGH pA

HSV-ΔTK-LSL-tdTomato

为解析TRAP（活性神经元群体靶向重组技术）标记的S2（次级躯体感觉皮层）与S1HL（初级躯体感觉皮层后肢区）谷氨酸能神经元的连接关系，研究人员在FosTRAP2小鼠（神经元激活时，c-Fos启动子驱动表达他莫昔芬诱导型Cre酶）的S2区注射Cre依赖性辅助病毒rAAV-Ef1α-DIO-EGFP-T2A-TK-WPRE-hGH pA，三周后于同一位点注射HSV-ΔTK-LSL-tdTomato病毒实现顺行跨单突触示踪。病毒表达后，首先在初级运动皮层、上唇区初级躯体感觉皮层、S1HL、LGP（外侧苍白球）及VP（丘脑腹后核）等脑区检测到tdTomato阳性信号。进一步免疫荧光分析显示，这些信号主要分布于S1HL第4层，且与谷氨酸抗体（约30%）和GABA抗体（约65%）共定位，证实TRAP标记的（TRAPed）S2神经元以层级特异性方式主要支配S1HL第4层的GABA能神经元。

图4. TRAPed S2神经元的输出

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