简介

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，病毒粒子呈球形，直径约150-200 nm，由二十面体衣壳、皮层和囊膜组成。其基因组为长度约150 kb的线性双链DNA，囊膜表面分布有gB、gC、gD等糖蛋白，介导病毒与宿主细胞的黏附与融合。通过同源重组等分子遗传学技术，PRV可定向插入超过10 kb的外源基因（如荧光蛋白、报告基因），为神经环路示踪提供灵活的基因编辑工具。

病毒株特性与神经示踪应用

自然宿主与安全性：PRV自然宿主为猪，啮齿动物可感染，灵长类动物对其敏感性极低。尽管PRV对实验人员致病性低，但仍需在生物安全二级（BSL-2）实验室中操作，采取黏膜防护（如护目镜、手套）等措施。

经典毒株对比：

Becker株：毒力强，可顺行及逆行跨突触传播，因安全性风险和示踪方向性差，极少用于神经科学研究。

Bartha株（疫苗株）：经基因缺失致弱，仅能逆向跨突触传播（从突触后神经元至突触前神经元），可沿神经轴突从外周快速向中枢神经系统扩散，是解析神经网络的常用工具株。

荧光标记株的技术优化

采用免疫荧光检测野生型PRV感染时（PRV抗原），信号通常较弱，需依赖免疫组化等信号放大技术进行检测。为解决这一问题，我司基于Bartha株开发PRV531（EGFP标记）和PRV724（RFP标记），将荧光蛋白基因插入非必需区域，实现高强度组成型荧光表达，无需免疫组化即可直接观察，成为高效的逆向跨多突触示踪剂，适用于标记神经元的多级上游输入连接。

PRV示踪的核心优势

跨突触传递能力：可逆向跨越多个突触层级，示踪全脑范围的输入神经网络；

基因工程灵活性：支持大片段外源基因插入，兼容荧光标记、基因表达调控等操作；

神经元特异性感染：高亲和力结合神经元受体，极少感染胶质细胞等非神经细胞。

图1.跨突触病毒标记细胞的方式（Xu X, Holmes TC, Luo MH, et al. Neuron. 2020）

图2.PRV感染在神经环路中的跨突触传播（Ekstrand MI, Enquist LW, Pomeranz LE. Trends Mol Med. 2008）

逆向跨突触示踪原理

1.逆向跨多级系统

病毒感染神经细胞后，其基因组释放并进入细胞核，一方面完成病毒DNA复制、转录及翻译等生命循环事件，另一方面可介导外源基因的表达。新产生的子代病毒粒子通过逆向轴突运输，从被感染神经元的突触后膜释放，继而侵入与之形成突触连接的突触前神经元，此过程称为逆向跨突触传播。病毒可在突触前神经元内再次复制，并重复上述逆向跨突触过程，实现跨多级神经网络的传播。

2.逆向跨单级系统

逆向跨单级系统的构建基于PRV Bartha株的胸苷激酶基因（TK）缺失突变。TK是病毒在神经细胞中复制的必需基因，其缺失会导致病毒无法在非分裂细胞（如神经元）中完成DNA合成，进而丧失产生子代病毒粒子的能力，阻断跨突触传播。当通过AAV载体向TK缺失病毒感染的神经元中补充TK基因后，病毒可恢复复制能力，仅能从该神经元逆向跨单级突触感染其上游突触前神经元。该系统可结合Cre/Flp重组酶介导的转基因动物模型，通过AAV辅助病毒递送TK基因或标记基因，实现对特定神经网络单级输入连接的精准解析。

适用的神经科学问题

1.研究大脑特定区域的全脑多级输入神经网络层级结构

利用PRV的逆向跨多级突触特性，解析目标脑区（如皮层、海马）接收的全脑范围内跨突触层级的输入连接网络，明确神经元之间的多级环路联系。

2.动态追踪神经发育过程中神经网络的连接重塑

通过不同发育阶段（如胚胎期、幼年期）的PRV示踪，研究神经网络形成、修剪及功能成熟过程中的输入连接变化，揭示神经发育的环路构建机制。

3.解析神经精神疾病模型中枢-外周传出神经网络的异常特征

在抑郁、自闭症等模型中，利用PRV追踪中枢神经系统至外周器官的传出通路（如边缘系统-内脏神经投射），分析疾病状态下传出网络的结构损伤或重塑模式。

4.量化神经损伤及康复模型中传出/传入网络的连接损伤与修复

结合PRV逆向追踪（研究传入连接）与顺向示踪技术，评估脑损伤（如脑卒中、脊髓损伤）后中枢-外周传出通路的损伤程度及康复过程中神经网络的再生与功能重建。

5.逆行追踪外周-中枢神经联系通路及运动系统传入网络

外周-中枢环路：通过PRV示踪四肢、内脏等外周器官向中枢神经系统的传入投射通路（如皮肤-脊髓-丘脑通路），解析躯体感觉或内脏感觉的中枢编码机制。

运动相关传入网络：逆行追踪运动系统的感觉传入通路（如肌肉、肌腱本体感觉向脊髓和脑的投射），研究四肢运动控制的中枢环路整合机制。

穴位神经投射：探索针灸穴位对应的外周神经-脊髓-脑区的传入连接路径，为穴位作用的神经机制提供解剖学依据。

图3.经淋巴结注射PRV152进行逆向跨多突触示踪（Sun L, Tang Y, Yan K, et al. Mol Neurodegener. 2019）

客户案例分享

客户文章（IF=11.7）：

Cao P, Liu Y, Ni Z, Zhang M, Wei HR, Liu A, Guo JR, Yang Y, Xu Z, Guo Y, Zhang Z, Tao W, Wang L. Rescue-like behavior in a bystander mouse toward anesthetized conspecifics promotes arousal via a tongue-brain connection. Sci Adv. 2025 Jan 24;11(4):eadq3874. doi: 10.1126/sciadv.adq3874. Epub 2025 Jan 22. PMID: 39841840; PMCID: PMC11753405.

使用我司病毒：

PRV-CAG-EGFP

研究人员采用基于病毒的示踪方法探究中脑三叉神经核(MTN)与舌之间的神经连接，具体操作如下：将逆行跨多级突触的伪狂犬病毒（PRV-CAG-EGFP，531#）注入C57小鼠舌内。注射后7天，经心脏灌注4%多聚甲醛固定小鼠，取脑制备冠状冰冻切片，随后对脑片进行谷氨酸特异性抗体免疫荧光染色。结果显示，在包括MTN在内的多个核团中观察到了EGFP+信号。进一步的免疫荧光染色显示，这些EGFP+神经元与谷氨酸特异性抗体呈共标阳性（即同时表达EGFP和谷氨酸），提示其为谷氨酸能神经元。

图4.MTNGlu神经元投射到舌

我司产品列表：

升级版PRV测试效果

逆标效率与第一代PRV产品等同，但荧光亮度显著增强。

图5.PRV531标记VHPC后2天取样制片。无需抗体染色，直接成像。

图6.PRV724标记VHPC后2天取样制片。无需抗体染色，直接成像。

常见问题解答

Q1:PRV注射后什么时间取材？

答：PRV为逆向跨多突触病毒，对动物具有较强感染毒性，动物感染病毒后存活时间一般为3~5天(中枢注射)，动物体质不同，存活时间也有差异。外周注射存活时间延长2~4天。因此，病毒注射后，可根据环路连接级数多少在不同时间点取样。在中枢，跨突触数目经验值为：跨1~2级，需24~48小时；跨2~3级，36~72小时；需经常查看动物状态，以免动物提前死亡，影响正常取样。

Q2:PRV注射滴度和体积一般是多少？

答：中枢注射：≥1E+8 PFU/mL(高浓度保证感染效率)；外周注射：≥5E+8 PFU/mL(因外周组织摄取效率低)。注射体积：中枢：50-200 nL(避免组织损伤)；外周：1-5 μL(肌肉/器官需分多点注射)。

Q3:病毒注射后无信号或信号弱的可能原因。

答：病毒滴度过低/注射位点偏差。可通过预实验验证定位坐标、提高病毒滴度2倍增强信号。

Q4:病毒注射后非特异性扩散的可能原因。

答：注射过快/体积过大/针道回流。需保持限速≤20 nL/s；退针分段停留；用更细针头。

注意事项：

1.中枢注射时：控制注射速度≤20 nL/s，避免组织损伤；

2.所有接触过病毒的废弃物需121℃高压灭菌30分钟或10%漂白剂浸泡后再丢弃。

3.病毒应适当分装，避免反复冻融。

参考文献：

[1].Liu Q, Wu Y, Wang H, et al. Viral Tools for Neural Circuit Tracing. Neurosci Bull. 2022 Dec;38(12):1508-1518.

[2]Xu X, Holmes TC, Luo MH, et al. Viral Vectors for Neural Circuit Mapping and Recent Advances in Trans-synaptic Anterograde Tracers. Neuron. 2020 Sep 23;107(6):1029-1047.

[3]Ekstrand MI, Enquist LW, Pomeranz LE. Trends Mol Med. 2008 Mar;14(3):134-40.

[4]Li J, Liu T, Dong Y, et al. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neurosci Bull. 2019 Oct;35(5):909-920.

[5]Qiu L, Zhang B, Gao Z. Lighting Up Neural Circuits by Viral Tracing. Neurosci Bull. 2022 Nov;38(11):1383-1396.

[6]Sun L, Tang Y, Yan K, et al. Differences in neurotropism and neurotoxicity among retrograde viral tracers. Mol Neurodegener. 2019 Feb 8;14(1):8.

[7]Cao P, Liu Y, Ni Z, et al. Rescue-like behavior in a bystander mouse toward anesthetized conspecifics promotes arousal via a tongue-brain connection. Sci Adv. 2025 Jan 24;11(4):eadq3874.