心肌纤维化的特征是心肌细胞外基质（ECM）蛋白的过度积聚和成分紊乱。它发生在多种心脏疾病中，并直接与心功能障碍和心律失常相关。心肌成纤维细胞（CFs）的活化及其向活性肌成纤维细胞的转化，是ECM过度产生和沉积的原因，这是病理性纤维化发生和发展的关键事件。探索有效的分子靶点以改善心脏病患者的心肌纤维化至关重要。

泛素化（Ubiquitination）作为一种蛋白翻译后修饰，对于维持和调节细胞稳态不可或缺，并在心血管疾病的病理生理过程中发挥着关键作用。E3连接酶（E3 ligases）作为对接蛋白，通过结合靶蛋白赋予泛素化特异性，随后这些靶蛋白被蛋白酶体降解。研究表明，E3连接酶在调控细胞增殖、分化和凋亡中发挥关键作用，因而与多种心脏疾病相关。

核斑点型POZ蛋白（Speckle-type POZ protein,SPOP）作为基于cullin 3的E3泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白，通过特异性识别底物以实现其泛素化和蛋白酶体降解，在多种细胞过程中发挥关键作用。研究显示，SPOP选择性结合靶蛋白的底物结合共识（substrate-binding consensus,SBC）基序，促进底物蛋白的泛素化及随后的降解。值得注意的是，SPOP在扩张型心肌病患者中被证明存在显著上调。这可能暗示了SPOP在心脏疾病中的潜在功能。

激活的蛋白激酶C受体1（Receptor for activated C-kinase 1,RACK1）是WD40重复蛋白家族成员，通过与其他蛋白相互作用参与多种生物和病理过程。据报道，RACK1与Smad3的相互作用在肾小管上皮细胞和人肾小球系膜细胞中对I型胶原转录具有抑制作用，并在神经干细胞中激活转化生长因子-β（TGF-β）/Smad信号通路。

近期，哈尔滨医科大学吕延杰/潘振伟教授与上海工程技术大学单宏丽教授团队合作，联合在Cell Chemical Biology发表题为“Substrate-dependent interaction of SPOP and RACK1 aggravates cardiac fibrosis following myocardial infarction”的研究论文，在本研究中，作者证明了SPOP通过与RACK1相互作用并促进其泛素化和降解，从而促进CFs增殖、胶原蛋白产生和心肌纤维化。RACK1在心肌中作为SPOP的一种纤维化相关底物，其降解反过来导致由Smad3通路介导的CFs活化。综上所述，本研究表明，SPOP和RACK1作为治疗靶点，在干预纤维化相关心脏病的发展方面具有巨大潜力。

1.心肌纤维化组织和成纤维细胞中SPOP的表达

为阐明SPOP在心肌纤维化中的作用，研究人员分别在体内和体外检测了其在纤维化刺激下的表达变化。与假手术组相比，左前降支冠状动脉（LAD）结扎4周后的心肌梗死（MI）心脏梗死边缘区中，SPOP在mRNA和蛋白水平上的表达均增加。与此一致的是，在用TGF-β1(20 ng/mL)处理24小时的培养CFs中，SPOP在mRNA和蛋白水平上的表达也上调。此外，免疫荧光染色显示，无论在对照组还是TGF-β1处理条件下，SPOP主要分布在成纤维细胞的细胞核中。而且，20%胎牛血清（FBS）处理也增加了CFs中SPOP的表达。

图1.MI小鼠心肌纤维化组织和TGF-β1或20%血清处理的CFs中SPOP表达增加

2.SPOP过表达促进CFs活化和心肌纤维化

为确定SPOP对CFs的影响，研究者在培养的CFs中转染SPOP过表达质粒，以观察胶原产生和细胞增殖情况。通过qRT-PCR和Western blot检测验证了SPOP过表达的效率。结果显示，SPOP的过表达显著增加了CFs中I型胶原（Col I）和III型胶原（Col III）的mRNA和蛋白水平，其效果与TGF-β1处理类似。SPOP过表达显著促进了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，这是CFs活化[成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）]的标志物。此外，通过EdU染色和MTT法检测发现，SPOP过表达促进了CFs增殖和细胞活力。这些数据表明，SPOP的上调激活了CFs，促进了胶原蛋白的产生和CFs增殖。

接着，研究人员在小鼠MI模型中验证SPOP对心肌纤维化的影响。小鼠予以尾静脉注射携带SPOP过表达质粒的慢病毒载体。注射慢病毒两周后，结扎LAD，并于四周后评估间质纤维化。结果显示，MI小鼠心肌中SPOP的蛋白水平显著升高，而过表达SPOP则使其进一步上调。值得注意的是，SPOP过表达加重了MI小鼠的心功能障碍，表现为射血分数（EF）和缩短分数（FS）进一步降低，以及左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）增加。Masson三色染色显示，SPOP过表达加重了MI后的间质纤维化并增加了梗死面积。此外，SPOP过表达显著增加了Col I和Col III的蛋白水平。

图2.过表达SPOP对心肌纤维化的影响

3.SPOP缺失减轻细胞活化和心肌纤维化

为进一步确认SPOP在CFs中的作用，研究者使用其两条siRNA（siRNA-1和siRNA-2）进行了SPOP功能缺失实验。siRNA-1和siRNA-2均在蛋白水平上显著降低了SPOP的表达。与SPOP过表达促进胶原表达的作用相反，siRNA敲低内源性SPOP抑制了CFs中Col I和Col III的表达。沉默SPOP显著抑制了TGF-β1在CFs中诱导的SPOP、Col I和Col III表达的增加。TGF-β1诱导的α-SMA表达、细胞增殖和细胞活力也因SPOP敲低而受到抑制。

接下来，作者探索了通过慢病毒携带的SPOP-shRNA敲低SPOP对MI小鼠心肌纤维化的影响。结果显示，给予SPOP-shRNA的小鼠心肌中SPOP蛋白表达被有效降低。超声心动图检查显示，SPOP缺失显著改善了MI后小鼠的心功能，表现为EF和FS增加，同时LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV也得到改善。重要的是，Masson三色染色证明，敲低SPOP减少了MI心脏的胶原沉积和梗死面积。在SPOP-shRNA处理组中也观察到Col I和Col III蛋白水平的降低。

图3.抑制SPOP对心肌纤维化的影响

4.SPOP结合RACK1的SBC基序以促进其在CFs中的降解

SPOP是识别底物的衔接蛋白，负责靶向底物并启动其泛素化及随后的蛋白酶体降解过程。为鉴定与SPOP相互作用的靶蛋白，研究人员在CFs中使用抗SPOP抗体进行免疫共沉淀(Co-IP)，并通过质谱(MS)分析与SPOP结合的蛋白。考马斯亮蓝染色结果显示，IP组（SPOP组）中，分子量约为35 kD处呈现高强度条带，而该条带在IgG组中几乎检测不到。在308个沉淀蛋白中，RACK1因其亚细胞定位、生物学功能以及与SPOP的相互作用能力引起了作者注意。研究人员随后证实RACK1与SPOP在CFs的核仁中共定位，并能被SPOP抗体特异性沉淀，反之亦然。重要的是，RACK1拥有SPOP的结合位点[富含丝氨酸/苏氨酸(S/T)的基序]，这对于其作为SPOP的底物进行后续泛素化至关重要。据报道，RACK1在肾小管上皮细胞和人肾小球系膜细胞中对Smad介导的Col I转录具有负向作用，并在神经干细胞中激活TGF-β/Smad信号通路。基于上述原因，RACK1被选为后续实验中SPOP的候选底物。

值得注意的是，过表达SPOP显著降低了CFs中RACK1的蛋白水平，但在mRNA水平未发现明显变化。泛素-蛋白酶体抑制剂MG132（5 μM，处理8小时）阻止了由SPOP过表达引起的RACK1蛋白水平下降。MG132处理的CFs中CO-IP实验（高分子量拖尾是泛素化蛋白的典型阳性信号）显示，SPOP过表达促进了RACK1的泛素化并下调其蛋白水平，而SPOP siRNA则抑制了RACK1的泛素化并上调了其蛋白水平。此外，SPOP缺失也抑制了MI小鼠心肌组织中RACK1的泛素化。这些结果表明SPOP能够与RACK1相互作用并促进其泛素化和降解。

SPOP包含两个结合结构域：位于N末端的底物结合结构域Meprin和TRAF同源(MATH)结构域，以及位于C末端的CUL3/Cullin3结合结构域Bric-a-brac/Tramtrack/Broad(BTB)结构域。为确定SPOP在RACK1上的结合结构域，作者构建了SPOP的MATH结构域缺失突变体(SPOP-ΔMATH)。293T细胞中Co-IP实验表明，全长SPOP(SPOP-WT)成功沉淀了RACK1，而SPOP-ΔMATH突变体则未能沉淀，表明SPOP通过其MATH结构域与RACK1结合。

富含S/T的基序存在于大量SPOP结合蛋白中，这对于底物与SPOP的结合尤为重要。SPOP的SBC基序（φ-π-S/T-S/T-S/T或π-φ-S/T-S/T-S/T，其中φ代表非极性残基，π代表极性残基）在已知的SPOP底物中已得到充分表征。据此，研究者分析了RACK1的氨基酸序列，发现了两个富含S/T的结合基序：94TGTTT98基序（第一个氨基酸T是苏氨酸，一种极性残基；第二个氨基酸G是甘氨酸，一种非极性残基）和275ISTSS279基序（第一个氨基酸I是异亮氨酸，一种非极性残基；第二个氨基酸S是丝氨酸，一种极性残基）作为潜在的SBC基序。为揭示这些区域对于SPOP识别RACK1是否不可或缺，作者构建了RACK1片段1（包含94TGTTT98基序的RACK1序列第1-179位氨基酸）、RACK1片段2（包含275ISTSS279基序的RACK1序列第180-317位氨基酸）以及两个富含S/T基序序列发生突变的RACK1突变体(Flag-RACK1△△)，该突变体将SBC基序突变为丙氨酸A（94AAAAA98基序和275AAAAA279基序）。Co-IP数据显示，RACK1片段1(1-179aa)和片段2(180-317aa)在293T细胞中均能成功沉淀SPOP，而RACK1△△（RACK1 SBC丙氨酸A突变体）则失去了沉淀SPOP的能力。这些结果表明，RACK1上的94TGTTT98和275ISTSS279区域均负责与SPOP的结合，并且RACK1是SPOP调控CFs中泛素化和降解的底物。

图4.SPOP的MATH结构域与RACK1的SBC基序相互作用并促进其在CFs中的降解

5.RACK1介导SPOP在心肌纤维化中的功能

为评估RACK1是否参与SPOP诱导的CFs活化，研究人员证实了RACK1的过表达抑制了SPOP在CFs中诱导的胶原蛋白生成。SPOP诱导的细胞活力、α-SMA表达和细胞增殖也均被共转染RACK1过表达质粒所消除。

随后，研究者构建了携带RACK1基因的慢病毒载体（len-RACK1）。将len-RACK1注射到len-SPOP给药的MI小鼠体内，并评估心肌纤维化情况。结果显示，SPOP过表达对心功能的不利影响被RACK1的功能获得所挽救。Masson三色染色显示，过表达RACK1阻止了SPOP过表达在MI小鼠中引起的纤维化面积增加。给予len-RACK1消除了在感染len-SPOP的MI小鼠中Col I和Col III表达的增加。这些结果表明RACK1介导了SPOP在心肌纤维化中的作用。

图5.RACK1调节SPOP对心肌纤维化的影响

6.RACK1通过Smad3通路抑制CFs活化

研究人员随后检测了RACK1在CFs活化中的作用。首先，验证了RACK1的成功过表达。RACK1过表达抑制了Col I和Col III的mRNA和蛋白水平表达。此外，RACK1过表达显著抑制了α-SMA表达、细胞活力和CFs增殖，暗示了其抗纤维化潜力。

接下来，研究者通过siRNA（siRACK1-1和siRACK1-2）敲低RACK1探究了其对CFs的影响。在CFs中，沉默RACK1在mRNA和蛋白水平均促进了Col I和Col III的表达。敲低RACK1有效促进了成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，表现为α-SMA表达增加、细胞活力增强和细胞增殖加快。已有研究表明，在肾细胞中，RACK1是Smad3的结合伙伴，并负向调控Smad结合元件（SBE）和α2(I)胶原启动子序列的转录活性。作者随后研究了Smad3是否参与RACK1对CFs胶原生成的调控。抗RACK1抗体成功地免疫沉淀出了Smad3蛋白。此外，Smad3 siRNA消除了RACK1沉默对CFs胶原合成的促进作用。这些发现表明，RACK1对CFs活化的作用是由Smad3介导的，而Smad3是纤维化过程中的关键介质。

为更深入地研究RACK1是否影响心功能和纤维化，小鼠通过尾静脉注射携带RACK1基因的慢病毒载体。注射两周后，结扎LAD，并在MI后4周评估间质纤维化情况。结果显示，RACK1过表达显著改善了MI小鼠的心功能，表现为EF和FS增加，LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV减小。重要的是，RACK1减少了胶原合成，减轻了间质纤维化，并缩小了MI后的梗死面积。

图6.RACK1通过Smad3抑制CFs活化

图7.敲低RACK1对Col I和Col III蛋白表达的影响

图8.过表达RACK1对心功能和纤维化的影响

7.SPOP在人CFs活化中发挥相似功能

最后，作者研究了SPOP在人CFs中的作用。一致地，TGF-β1刺激后SPOP的蛋白水平升高。靶向人SPOP的siRNA（hsiSPOP）降低了经TGF-β1处理的人CFs中SPOP、Col-I、Col-III以及α-SMA的表达。此外，沉默SPOP抑制了TGF-β1诱导的人CFs的细胞活力和增殖。这些发现凸显了SPOP作为人类纤维化疾病治疗靶点的潜力。

图9.沉默SPOP抑制TGF-β1诱导的人CFs活化

总结与局限

本研究的主要发现是：

(1)SPOP在小鼠缺血诱导的心肌纤维化组织以及TGF-β1诱导的CFs纤维化表型中均表达上调；过表达SPOP促进胶原生成和心脏间质纤维化，并恶化心功能；而敲低SPOP则表现出相反的效果。

(2)SPOP与RACK1结合，促进其泛素化及随后的降解，从而增加了由Smad3介导的CFs增殖和胶原合成。

(3)RACK1通过其富含S/T的基序与SPOP的MATH结构域结合，被SPOP识别并靶向。本研究证实SPOP通过结合RACK1（泛素化介导降解的底物蛋白）而加剧了缺血诱导的心肌纤维化，进而导致Smad3介导的CFs活化。

总体而言，E3泛素连接酶复合体衔接蛋白SPOP通过增强其底物蛋白RACK1的泛素化介导降解，促进了心肌纤维化的发展。该研究推动了对心肌纤维化分子机制的进一步认识，并为纤维化相关心脏疾病提供了策略与靶点。

研究局限性：尽管本研究证明了SPOP在心肌纤维化中的调控作用，但该工作仍存在一些局限性。为了进一步确认SPOP在心肌纤维化中的促纤维化功能，有必要在研究中采用CFs特异性的SPOP敲除或转基因小鼠。本研究不能排除其他底物/机制或其他类型细胞（如心肌细胞和/或内皮细胞）参与SPOP在心肌纤维化中的调控。最后，若能在人类心肌纤维化中证实SPOP的功能，则将进一步加强本研究的意义。

模式图：SPOP与RACK1相互作用加剧心肌纤维化

通讯作者介绍：

吕延杰，教授，博士生导师，中国药理学会心血管药理专业委员会名誉主任委员、黑龙江省药理学会副理事长，主要从事心血管疾病的基础和药理学科研工作，研究方向为离子通道和心血管疾病，干细胞在心脏疾病中的应用，非编码RNA（微小RNAs和长链非编码RNAs）在心血管系统疾病中的病理生理作用和调控机制。主持国家自然科学基金重点项目等研究课题；获教育部自然科学一等奖、黑龙江省政府等省部级科技奖励10余项；编写国家规划教材3部；以第一/通讯作者在Circulation、Circulation Research等期刊发表SCI论文50余篇。

潘振伟，男，中共党员，教授，博士生导师，教育部青年长江.学者特聘教授，哈尔滨医科大学药学院药理教研室教授，现任哈尔滨医科大学基础医学院院长。二级教授/国家高层次人才/黑龙江省B类人才。黑龙江省医学科学院北方转化医学研究合作中心主任。研究方向为心脏疾病及代谢疾病的分子机制与防治策略，在Circulation、Circulation Research、Journal of the American College of Cardiology、The Journal of Clinical Investigation、Nature Communications等杂志发表论文60余篇。主持科技部国家重点研发计划课题2项、国家自然基金重点项目1项、国家自然基金面上项目4项、教育部新世纪人才计划1项、黑龙江省杰出青年基金1项。获中国药理学会施维雅优秀青年工作者奖、中国药学会青年生物药物奖、黑龙江省科技进步二等奖（第一完成人）。2017年被评为黑龙江省劳动模范称号。受邀多次在心血管领域学术会议如ISHR国际心脏病大会、海峡两岸心血管会议、南方心血管疾病会议等做学术报告。

单宏丽，上海工程技术大学，化学化工学院，教授，享有国务院政府特殊津贴。承担多项国家自然科学基金面上项目、黑龙江省自然科学基金重点项目、黑龙江省杰出青年科学基金项目、及国家重点基础研究发展计划（973项目）等。以通讯作者身份在Autophagy、Nat Commun、Theranostics等发表多篇SCI论文。研究方向：1.心血管药理学2.肿瘤药理学。

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