糖尿病（Diabetes mellitus，DM）正因多种伴随并发症（包括糖尿病肾病、心肌病、神经病变和视网膜病变）而成为全球主要的死亡原因。糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy,DCM）以心室重构和间质纤维化为特征，并最终导致心力衰竭。其发病率高，但发病机制尚未完全阐明，治疗手段也有限。近期研究发现DCM中的心肌损伤与心肌纤维化相关，这种不可逆的病理改变会破坏正常组织结构，使心功能从代偿期转为失代偿期。DM患者心脏磁共振成像显示对比增强T1时间缩短，且右心室活检标本中间质纤维化程度与射血分数呈负相关。尽管具有重要临床意义，DM相关心肌纤维化的病理机制仍不明确。

心肌成纤维细胞（Cardiac Fibroblasts,CFs）的异常增殖和分化被认为是DM心肌纤维化的关键因素。DM心脏中过量的细胞因子（尤其是转化生长因子β（TGF-β））可通过诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化而激活其功能，表现为收缩蛋白（如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA））和细胞外基质（ECM）相关蛋白表达增加。此外，研究表明高糖（HG）可诱导I型和II型TGF-β受体（激活素受体样激酶ALK5和ALK1）的激活和内吞，从而增强下游R-SMADs信号传导。然而，关于HG如何具体促进TGF-β信号传导及后续成纤维细胞激活的机制仍需深入研究。

CD147（Cluster of Differentiation 147,分化簇147）是免疫球蛋白超家族成员，这种跨膜糖蛋白在多种癌症中表达上调。高度糖基化的CD147能有效刺激基质金属蛋白酶生成，促进肿瘤生长、侵袭和转移，已成为多种癌症的潜在治疗靶点。研究显示，CD147在心肌梗死、炎症性心肌病和扩张型心肌病患者左心室（LV）中表达上调。研究表明CD147可能参与肝脏和肾脏等器官的肌成纤维细胞分化和纤维化进程，但其在DCM病理性纤维化中的作用及机制仍待阐明。

近期，空军军医大学唐都医院心血管内科李妍主任医师/胡健强副主任医师团队在《International Journal of Biological Sciences》期刊发表了题为“N-glycosylation-mediated CD147 accumulation induces cardiac fibrosis in the diabetic heart through ALK5 activation”的研究论文。该研究发现：DM小鼠心肌组织和DM患者右心房样本中CD147显著上调，并伴随心脏重构和心功能损伤；AAV9介导的心脏特异性CD147沉默减轻DM小鼠心肌纤维化并改善心功能。体外实验进一步显示CD147敲低显著抑制HG诱导CFs的活化和增殖。机制上，CD147直接结合I型TGF-β受体（ALK5），促进ALK5激活和内吞，从而诱导SMAD2/3磷酸化和核转位。此外，HG微环境通过增强GNT-V介导的N-糖基化，抑制泛素-蛋白酶体途径介导的CD147降解。值得注意的是，心脏特异性CD147过表达可在正常小鼠中模拟DM诱导的心肌纤维化及相关心功能障碍。综上，本研究揭示N-糖基化介导的CD147蓄积诱导CFs持续活化，为DCM相关心肌纤维化提供了新的治疗靶点。

 

1、STZ诱导DM小鼠心脏表现出过度的胶原沉积和CD147表达上调

与对照组小鼠相比，STZ诱导的DM小鼠（连续5天腹腔注射0.1 g/kg体重链脲佐菌素，随机血糖＞16.6 mmol/L的小鼠被视为DM模型成功建立）在注射STZ 3个月后血糖水平显著升高，而体重和葡萄糖耐量显著下降。超声心动图显示，STZ注射小鼠心功能明显受损，表现为左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）降低，左心室收缩末期内径（LVIDs）和左心室舒张末期内径（LVIDd）增大。此外，多普勒超声心动图二尖瓣血流模式分析显示DM小鼠存在舒张功能障碍，E/A比值（二尖瓣血流频谱）较对照组降低。心肌纤维化是DCM的主要病理特征。HE和Masson三色染色分析显示，与对照组相比，DM小鼠心肌间质纤维化范围更广、心腔更大。免疫组化染色和Western blotting进一步证实DM小鼠心肌组织中胶原蛋白（I型胶原COL1a和III型胶原COL3a）沉积显著增加。定量蛋白组学分析显示，DM小鼠心脏中跨膜糖蛋白CD147表达上调。免疫组化和免疫荧光（IF）染色结果验证了这一发现。Western blotting也显示DM小鼠心肌组织及HG刺激的原代CFs中CD147蛋白表达升高。但实时荧光定量PCR显示，无论在组织或细胞水平，CD147的mRNA表达量均无显著差异。

图1. STZ诱导的DM小鼠心脏表现出过度的胶原沉积和CD147表达上调

2、沉默CD147减轻DM小鼠心脏的功能障碍和纤维化

通过应用AAV9-shCD147进行CD147功能缺失实验，作者探究了CD147是否在DM中调控心功能。研究者将8周龄野生型（WT）小鼠与DM小鼠分别随机分为两组，14周龄时一组注射AAV9-shCD147，另一组注射AAV9-shNC，于注射后2、4、6 w利用Western blotting检测CD147蛋白水平，结果显示，病毒在注射后2 w开始显现效果，注射后4 w时达到峰值效应并持续至注射后6 w。免疫组化结果也表明，AAV9-shCD147在注射后6 w显著抑制CD147表达，证实病毒注射成功且具有高效抑制效果。对照和模型小鼠中，AAV9-shCD147对血糖及体重均未产生显著影响。然而，超声心动图显示：当心肌组织中CD147表达下调时，DM小鼠的心功能显著改善且心脏不良重塑得到缓解，具体表现为E/A比值、LVEF和LVFS升高，LVIDs和LVIDd缩小。此外，HE和Masson三色染色显示：DM小鼠中与shNC组相比，shCD147组的心肌纤维化区域减少且心腔缩小，凸显了靶向抑制CD147在DM中的抗纤维化作用。免疫组化染色、蛋白质印迹和实时定量PCR分析也表明，DM小鼠CD147敲低后心肌组织中COL1a和COL3a的沉积减少，纤维化标志物（包括COL1a、COL3a和α-SMA）的表达降低。然而，注射AAV9-shCD147的DM小鼠中，纤维化核心调控因子TGF-β的蛋白和mRNA水平未发生显著变化，表明CD147敲低不影响TGF-β的表达。对照小鼠心脏中敲低CD147对心功能和纤维化无显著影响。

3、CD147参与HG诱导CFs活化

成纤维细胞是心肌纤维化的主要效应细胞，既往研究证实HG可促进成纤维细胞的活化与增殖。通过体外高糖（33 mM）刺激模拟DM状态，研究人员发现HG显著上调CFs中COL1a、COL3a、TGF-β及α-SMA的表达水平，并显著促进CFs增殖。为进一步探究CD147是否介导HG诱导的成纤维细胞活化与增殖，研究者采用腺病毒介导的shRNA（Ad-shCD147）敲低CFs中CD147表达。IF与蛋白质印迹结果显示，CD147下调显著抑制了HG诱导的COL1a、COL3a、TGF-β及α-SMA表达上调。此外，CD147 shRNA明显逆转了HG对CFs增殖的促进作用。然而，流式细胞术与蛋白质印迹分析表明，CD147敲低并未影响HG组与对照组（5 mM）CFs的凋亡水平及cleaved-caspase-9（caspase-9通过裂解激活，形成cleaved-caspase-9，从而启动细胞凋亡的级联反应）表达量。

 

4、CD147激活HG诱导CFs中TGF-β下游信号通路

研究表明TGF-β是一种“关键”细胞因子/生长因子，在损伤或病变组织中通过经典SMAD信号通路激活成纤维细胞并促进ECM生成。为探究CD147调控HG诱导CFs活化与增殖的分子机制，研究者在HG诱导CFs中利用腺病毒敲降CD147（Ad-shCD147）。IF与蛋白质印迹分析显示，HG处理激活了TGF-β/SMAD信号通路。与HG+Ad-shNC组相比，敲低CD147显著抑制TGF-β下游SMAD2/3的核转位，并降低p-SMAD2和p-SMAD3蛋白水平。Cyclin D1作为p-SMAD2/3的靶蛋白，通过调控细胞周期促进细胞增殖；相较于HG+Ad-shNC组，HG+Ad-shCD147组Cyclin D1的表达水平也显著降低。然而，CD147的下调未能逆转HG刺激后TGF-β及其受体ALK5（TGFβ-RI）和ALK1（TGFβ-RII）的表达升高。这些结果表明，CD147通过调控TGF-β信号通路的活化发挥作用，而非通过影响TGF-β及其受体的表达实现。

 

5、CD147通过促进ALK5活化与内吞作用调节HG诱导的SMAD2/3磷酸化及核转位

为探究CD147调控TGF-β信号通路活化的机制，研究者在分离的原代CFs中进行免疫共沉淀（Co-IP）实验，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，进而发现CD147能与分子量为55 kDa的TGF-β I型受体（ALK5）相互作用，于是选择该靶点进行深入研究。通过后续系列实验作者验证了HG诱导CFs中CD147与ALK5的相互作用：IF分析显示CD147与ALK5在CFs中显著共定位；Co-IP实验证实CD147抗体可下拉ALK5蛋白，反之亦然。研究显示ALK1首先与TGF-β结合，随后招募并磷酸化ALK5的激酶结构域，进而磷酸化SMAD蛋白。研究人员通过Co-IP分析进一步发现CD147敲低减弱了ALK1与ALK5、磷酸化ALK5的相互作用。磷酸化的ALK5会脱离细胞膜并内化至早期内吞体（即“内吞作用”），这一过程对SMAD2/3的磷酸化至关重要。IF分析进一步证实HG促进了ALK5内吞至细胞内区室，而CD147敲低阻断了此现象。位于早期内吞体的“受体激活的SMAD锚定蛋白（SARA）”是ALK5介导SMAD2/3磷酸化的必要条件，同时可作为早期内吞体标志物。研究者分析了ALK5与SARA的空间定位及CD147敲低对其共定位的影响。结果显示，HG增加了ALK5与SARA的共定位（表现为更多黄色阳性点），而CD147敲低显著降低ALK5-SARA共定位。综上所述，这些结果表明CD147可能作为支架蛋白促进ALK5的活化与内吞，从而最终激活TGF-β下游信号通路。

图3. CD147促进ALK5活化和内吞，从而调节HG诱导的SMAD2/3磷酸化和核转位

6、HG促进CD147糖基化并抑制其泛素-蛋白酶体降解

为探究HG调控CD147表达的机制，研究人员检测了CD147的转录水平及降解过程：Western blotting与实时荧光定量PCR结果显示，HG处理显著增加了CD147的蛋白表达水平，但未改变其mRNA水平，提示CD147受非转录水平调控。由于CD147是一种可发生翻译后修饰（如糖基化）的跨膜糖蛋白，作者进一步分析了其糖基化程度。结果显示，HG显著增强CD147糖基化，而糖基化抑制剂衣霉素（TCM）逆转了此效应。随后研究人员利用蛋白合成阻断剂环己酰亚胺（CHX）探究糖基化与蛋白稳定性的关系发现：HG处理延缓了CHX干预下CD147蛋白水平的降解，而TCM消除了此稳定作用。N-乙酰葡萄糖胺转移酶V（GNT-V）是肿瘤转移中CD147糖基化的关键酶，作者验证了其在CD147糖基化中的作用：Co-IP实验证实CFs中CD147与GNT-V存在相互作用，且HG处理进一步上调GNT-V表达；敲低GNT-V显著降低HG处理的CFs中CD147蛋白及糖基化水平。研究者进一步通过Co-IP分析发现，高效可逆的蛋白酶体抑制剂MG-132显著减少了HG诱导CFs中CD147的泛素化。而TCM与敲低GNT-V均可逆转此效应，并显著降低HG处理的CFs中CD147、COL3a及α-SMA的表达水平。此外，研究人员证实DM小鼠模型中，干扰GNT-V表达降低了CD147糖基化水平、增加其泛素化，从而减少胶原沉积并改善DM状态下的心功能异常。综上，HG通过上调GNT-V表达促进CD147糖基化，进而抑制其泛素-蛋白酶体降解途径，最终维持CD147蛋白稳定性。

图4. HG促进CD147糖基化并抑制其泛素-蛋白酶体降解

7、对照小鼠中过表达CD147模拟了DM诱导的心肌纤维化

为评估CD147过表达是否加剧正常小鼠心功能障碍和纤维化，研究人员通过心内注射AAV9-CD147来提高心肌组织CD147表达。研究者将8周龄野生型（WT）小鼠与DM小鼠分别随机分为两组，14周龄时一组注射AAV9-CD147，另一组注射AAV9-EV，于注射后2、4、6 w利用Western blotting检测CD147蛋白水平,结果显示，病毒在注射后2 w开始显现效果，注射后4 w时达到峰值效应并持续至注射后6 w。免疫组化进一步证实，AAV9-CD147在注射后6 w显著提升CD147表达，表明病毒注射成功且过表达效率高。对照和DM小鼠中，AAV9-CD147对血糖及体重均无显著影响。超声心动图分析显示，与CON+AAV9-EV组相比，外源性CD147显著损害对照小鼠心脏收缩和舒张功能（即CON+AAV9-CD147组心功能障碍），表现为E/A比值、LVEF和LVFS降低，LVIDs和LVIDd升高。HE和Masson三色染色证实外源性CD147引发对照小鼠不良心脏重构。免疫组化染色显示AAV9-CD147组COL1a和COL3a沉积量较AAV9-EV组显著增加。外源性CD147注射后，COL1a、COL3a及α-SMA的mRNA和蛋白水平均显著上升。值得注意的是，TGF-β表达未受CD147过表达影响。这些结果同时表明CD147过表达加剧了DM小鼠心功能障碍并促进心肌纤维化。

为探究CD147对心肌细胞的作用，作者构建了由cTnT启动子驱动的AAV9-cTnT-CD147载体，确保CD147在心肌细胞特异性表达并持续一个月。结果显示，对照小鼠中AAV9-cTnT-CD147未能模拟DM诱导的心功能异常。免疫组化和Western blotting进一步证实AAV9-cTnT-CD147组未见明显胶原沉积，再次验证了CD147通过CFs发挥促纤维化作用。

8、DM患者血清及心肌组织中CD147调控与心功能研究

本研究分析了接受心脏瓣膜置换手术的糖尿病患者（DM）、糖尿病前期患者（Pre-DM）及年龄匹配的非糖尿病受试者（Non-DM）的临床数据（包括超声心动图及临床样本）。结果显示，DM组空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）水平显著高于Non-DM组；Pre-DM组FBG水平介于DM组与Non-DM组之间，但其HbA1c水平与Non-DM组无显著差异。超声心动图数据显示，DM组存在收缩与舒张功能障碍，表现为E/A比值、LVEF和LVFS降低。Pre-DM组较Non-DM组表现出一定程度的舒张功能异常，但其室间隔厚度未增加。CD147 ELISA检测显示，Pre-DM组血清CD147水平相较于Non-DM组虽无统计学差异但呈升高趋势，而DM组血清CD147水平显著高于Non-DM组。此外，DM组心肌组织中COL1a、COL3a、CD147及α-SMA表达水平均高于Non-DM组，与临床前研究数据一致。

结论与局限

本研究揭示了CD147在DCM心肌纤维化中的关键作用，提示CD147可能成为治疗DCM的新靶点。创新性地发现CD147的N-糖基化通过增强蛋白稳定性加速DM心肌纤维化进程。提出创新机制：CD147通过促进早期内吞体中ALK5的激活和内化，增强下游SMADs信号转导，从而介导DCM心肌纤维化。HG环境促进CD147糖基化，通过抑制其泛素化降解导致胶原异常沉积和心功能损伤。这些发现为开发基于CD147的DCM治疗策略提供了理论依据。然而本研究存在以下局限：第一，未采用CFs特异性CD147基因敲除小鼠，但通过体外CFs系列实验和心脏特异性AAV9-CD147过表达模型进行了佐证；第二，对ALK5激活和内吞作用的具体机制仍需深入解析；第三，CD147糖基化与泛素降解通路的相互作用有待进一步阐明。

本研究工作由国家自然科学基金（No.82070385、82000350）及陕西省高校科学技术协会青年人才基金（No.20210305）资助。

 

通讯作者介绍：

李妍，心血管内科主任，教授，博士生(后)研究生导师。先后留学日本大阪大学，美国斯坦福大学斯坦福医院。享受空军优秀人才岗位津贴。现任美国心脏学会专家委员(FACC)、美国心血管造影及介入学会专家委员(FSCAI)、中国医师协会心血管分会全国委员、全军心血管分会常委、首批国家卫健委介入培训导师等。从事心血管疾病介入治疗20余年，擅长各种心血管复杂危重疾病治疗，老年瓣膜病不开胸介入治疗、复杂冠心病(钙化、左主干、慢性闭塞病变)介入治疗，房颤左心耳封堵治疗、缓慢性心律失常起搏器治疗等。担任《JACC Cardiovasucar Imaging》编委、《中华心血管病学》审稿人、《心脏杂志》常务编委等，主持国家支撑计划子课题、国自然、军队省部级课题19项，获空军高层次科技人才资助，在Circulation，Diabetolocia等杂志发表SCI及核心期刊论文90余篇，最高影响因子23.603。获中华医学会医学科学技术奖一等奖、军队医疗成果一等奖。荣获中华医学会青年菁英奖、领衔获批陕西省科技创新才队、陕西省青年科技奖，荣立个人三等功1次，获陕西省三八红旗手称号。

 

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