基因编码钙指示剂（Genetically Encoded Calcium Indicators,GECIs）作为在体神经活动监测的核心工具，已取得显著进展。基于绿色荧光蛋白（GFP）家族开发的GECIs（如GCaMP系列），通过多轮迭代优化，能够在斑马鱼、小鼠乃至非人灵长类等模式生物中实现神经元活动的高灵敏度、高时空分辨率监测。相较于绿色GECIs，红色GECIs具有特定优势，如深层组织成像、与绿色指示剂进行光谱复用。然而，红色GECIs研发与优化进展显著滞后，现有变体种类有限，且在体性能亦逊色于绿色GECIs。基于此现象，西湖大学生命科学学院Kiryl D. Piatkevich教授团队成功开发出首个高灵敏度体细胞定位红色荧光钙指示剂。相关研究内容发表在bioRxiv（题为“A Sensitive Soma-localized Red Fluorescent Calcium Indicator for Multi-Modality Imaging of Neuronal Populations In Vivo”的预印版文章，目前文章已被PLOS Biology期刊接收）。该研究中，作者为提升红色基因编码钙指示剂FRCaMP活体性能，利用拓扑倒置方法将其改造为FRCaMPi（钙结合亲和力提高），并在此基础上结合胞体靶向策略，进一步将FRCaMPi改造为SomaFRCaMPi（胞体靶向）。体内外实验中，相较于广泛应用的jRGECO1a（红色荧光钙成像领域的标杆工具）及其胞体定位版，SomaFRCaMPi灵敏度更高，并能媲美高性能绿色胞体定位GECI—RiboL1-GCaMP8s。

1、FRCaMPi的改造及性能

俄罗斯库尔恰托夫研究所Fedor V. Subach实验室2020年开发了新型红色GECI—FRCaMP，其动态范围与首个红色基因编码钙指示剂R-GECO1相当，但灵敏度更高。此外，FRCaMP不与哺乳动物细胞的细胞质环境相互作用。于是，作者通过改变FRCaMP的拓扑结构以优化其性能（提高配体结合亲和力）。具体而言，研究者利用柔性连接肽（GGSGGSGSGS）将M13肽（钙调蛋白CaM结合靶标）与CaM（钙结合蛋白）的末端进行连接，并恢复mApple（红色荧光蛋白，比mCherry更亮）蛋白的原始末端构型，将这种非环状排列的ncpFRCaMP命名为拓扑倒置的FRCaMPi（“i”代表“inverted”）。体外表征显示FRCaMPi的钙离子解离常数（Kd）较FRCaMP降低约60%。同时，FRCaMPi保留了FRCaMP宽广的动态范围。基于其钙结合亲和力增加与继承自FRCaMP的核心特性（如宽动态范围），研究人员进一步在培养神经元中通过87 Hz、300个动作电位（AP）的电刺激诱发钙信号，比较FRCaMPi与FRCaMP的性能。结果显示，FRCaMPi的峰值荧光响应强度达到FRCaMP的2倍多。表明FRCaMPi灵敏度提高，展现出在体外及体内神经元研究中广泛应用的潜力。

2、培养哺乳动物细胞中FRCaMPi的性能

鉴于FRCaMPi在初步体外表征中展现出更高灵敏度，研究者将其性能与当前主流的红色钙指示剂进行系统性对比。为验证FRCaMPi在哺乳动物细胞中的适用性，HeLa细胞实验结果显示FRCaMPi与jRGECO1a（灵敏度、动态范围等性能满足多数实验需求，适合在体成像）基线亮度相近、前者光漂白速率更快。研究人员为评估FRCaMPi监测HeLa细胞内钙信号的能力，记录了细胞在连续施加组胺（50 μM）与离子霉素（5 μM）刺激下（诱导胞质钙瞬变）的荧光响应，结果显示，在药理学诱导的钙变化过程中，表达FRCaMPi的HeLa细胞最大荧光响应（ΔFmax/Fmin）至少是jRGECO1a的2倍。综上所述，FRCaMPi在维持基线荧光的同时表现出更广的动态范围。

接下来，研究者采用成熟的电刺激方案（适用于jRGECO1a等），系统定量评估了FRCaMPi在原代小鼠海马神经元中的ΔF/F₀、信噪比（SNR）。通过向神经元施加不同脉冲数（1、2、3、5、10、20、40、80、160次）的场刺激（45-50 V，83 Hz，1 ms），并在记录前进行5分钟预照明以平衡光漂白效应。神经元胞体荧光检测显示，在单脉冲刺激下，FRCaMPi的峰值ΔF/F₀比jRGECO1a高约60%。随着脉冲数增加，始终比jRGECO1a高约50%。此外，FRCaMPi基线亮度与jRGECO1a无显著差异。尽管基线亮度相近但光漂白更快，FRCaMPi在5分钟照明后的峰值SNR仍与jRGECO1a相当，这得益于其更高的灵敏度（峰值ΔF/F₀高）。总体而言，FRCaMPi能够可靠地反映培养哺乳动物细胞中的Ca²⁺动态变化，且相较于jRGECO1a，其动态范围更宽和灵敏度更高。

研究表明红色GECIs在活体长期表达时性能显著下降。因此，研究者通过光纤光度法评估了FRCaMPi在中央杏仁核（CeA）神经元中的荧光响应。结果显示，即使表达三个月后，FRCaMPi在舔舐行为与气喷刺激中仍表现出稳定可重复的信号。基于上述实验结果，作者决定进一步优化该探针的胞体靶向版本。

图1. FRCaMPi在HeLa细胞中的特性表征

3、胞体靶向FRCaMPi的开发及性能

研究者在FRCaMPi的C端添加了四种已知可促进胞体定位的肽段，并在培养神经元中评估了其荧光变化（峰值ΔF/F₀）、电刺激响应SNR。基于筛选结果，研究人员选择RPL10（核糖体蛋白L10）标记的FRCaMPi进行后续研究，并将该变体命名为SomaFRCaMPi。RPL10肽段此前已被用于开发GCaMP6探针的胞体定位版本，该肽段是60S核糖体亚基的组成部分。为验证SomaFRCaMPi是否具有红色光谱区间的竞争优势。首先，作者在培养神经元中表征了SomaFRCaMPi的亚细胞定位（胞体定位）。前人研究提示核糖体标记可能降低基线荧光，于是研究者进一步实验探索，结果显示，SomaFRCaMPi、SomajRGECO1a分别与对应的非胞体定位版（FRCaMPi、jRGECO1a）比较，SomaFRCaMPi基线亮度降幅更小。此外，SomaFRCaMPi基线亮度是SomajRGECO1a的2倍多。

随后，研究者通过电场刺激实验对SomaFRCaMPi进行功能表征。在培养神经元中，SomaFRCaMPi显示出高灵敏度。其峰值ΔF/F₀在1-160脉冲范围内保持单调递增趋势，未见明显饱和。相较于SomajRGECO1a，SomaFRCaMPi在所有脉冲数下峰值ΔF/F₀更高，在40-160脉冲区间约为SomajRGECO1a的2倍。尽管存在初始光漂白，SomaFRCaMPi在所有脉冲数下的SNR至少是SomajRGECO1a的2倍，这得益于其更高的峰值ΔF/F₀和基线亮度。这些结果证明SomaFRCaMPi在培养神经元中具有高灵敏度和出色的钙信号报告能力。

4、斑马鱼幼鱼中SomaFRCaMPi特性表征

斑马鱼幼鱼的透明特性为全脑成像提供了可能（具有空间精度和细胞分辨率），可用于研究行为相关神经环路功能。于是，作者探究了胞体靶向SomaFRCaMPi是否也适用于斑马鱼的功能成像，并比较其相对于非靶向探针的优势。为此，研究人员构建了全脑神经元分别表达jRGECO1a、FRCaMPi及SomaFRCaMPi的转基因品系，并在幼鱼中开展平行性能比较。对F3代6日龄幼鱼的探针表达分析显示：SomaFRCaMPi特异性定位于神经元胞体。基于SomaFRCaMPi更清晰的胞体成像优势，采用Cellpose进行自动分割。结果显示，SomaFRCaMPi可识别神经元数量至少达FRCaMPi的2倍。动态性能评估方面，首先通过外部电刺激（60 V，持续1秒）诱导全脑可重复响应，记录延髓上段胞体的神经元反应。结果显示，SomaFRCaMPi表现出高峰值ΔF/F₀和SNR。进一步采用更具生物学意义的视觉逼近刺激（looming），在视网膜神经节细胞（RGC）输入激活的视顶盖区记录神经元活动。结果提示，SomaFRCaMPi峰值荧光响应与SNR的胞体-神经纤维比值更高。上述结果证实SomaFRCaMPi在斑马鱼中具有功能适配性，能高灵敏度记录神经元胞体信号。

5、小鼠神经元群体双光子钙成像研究

双光子（2P）显微镜凭借优异的光学切片与深层组织成像能力，可获取高对比度、高细胞分辨率的功能图像，尤其适用于小鼠大脑等散射组织的活体成像。研究人员利用腺相关病毒（AAV）在初级视皮层（V1皮层）表达jRGECO1a、FRCaMPi及SomaFRCaMPi，记录清醒小鼠L2/3神经元对八方向漂移光栅的响应。结果显示，SomaFRCaMPi荧光信号严格定位于胞体；SomaFRCaMPi在L2/3单视野（FOV）内记录的响应神经元数量是jRGECO1a的2倍多。接下来，研究者依据监测到的响应神经元比例和每个神经元的峰值ΔF/F₀的累积分布，来分别量化和比较灵敏度。结果显示，SomaFRCaMPi记录的响应细胞比例比jRGECO1a高约50%；SomaFRCaMPi峰值ΔF/F₀累积分布明显右移，表明SomaFRCaMPi比jRGECO1a具有更高的灵敏度。此外，与jRGECO1a相比，SomaFRCaMPi在L2/3神经元中也表现出更高的SNR值（分布右移）。为进一步评估SomaFRCaMPi在活体深层组织成像过程中的性能，研究人员记录了L5神经元的视觉刺激诱发活动。结果显示，L5神经元中峰值ΔF/F₀分布模式与L2/3神经元中类似，SomaFRCaMPi与jRGECO1a比较，峰值ΔF/F₀更高；SomaFRCaMPi记录的响应细胞比例几乎是jRGECO1a的3倍。同时，在L5神经元中，研究者发现jRGECO1a和SomaFRCaMPi的SNR均降低。这些结果表明SomaFRCaMPi在2P成像下能报告更深层皮层的神经元活动，但与L2/3神经元的2P成像相比，灵敏度下降。

鉴于SomaFRCaMPi在视觉皮层中表现出优异性能（灵敏度高、SNR高），作者进一步研究了其长期表达性能，特别是通过自发活动记录分析钙瞬变信号。针对普遍关注的核填充及长期表达中指示剂响应衰减问题，评估了SomaFRCaMPi的表现。结果显示，在V1区L2/3层表达4个月后，SomaFRCaMPi与jRGECO1a均未出现显著核填充，仅观察到微量核内信号。在表达6周时，SomaFRCaMPi的自发钙瞬变峰值ΔF/F₀较jRGECO1a更高，且SNR相当。而时间延长到4个月，SomaFRCaMPi与jRGECO1a峰值ΔF/F₀降幅一致（约30%），表明灵敏度均下降。但SomaFRCaMPi仍保持比jRGECO1a高约38%的峰值ΔF/F₀。此外，SomaFRCaMPi的峰值SNR仅下降4.4%，约为jRGECO1a降幅（8.8%）的一半。总的来说，即使表达4个月后，SomaFRCaMPi峰值ΔF/F₀更高、SNR略高。这些结果表明，SomaFRCaMPi可在长期实验中稳定报告神经元活动且SNR降幅较小，凸显其长期钙成像应用的潜力。

研究表明，RiboL1-GCaMP8s是迄今最灵敏的胞体定位绿色GECI，且在体荧光响应与非靶向jGCaMP8s相当。于是，为评估SomaFRCaMPi与RiboL1-GCaMP8s的灵敏度差异，研究者在脑干孤束核（NTS）中共表达RiboL1-GCaMP8s与SomaFRCaMPi，并通过双色2P成像监测神经元对内脏器官刺激的响应。结果显示，共表达绿色和红色探针的神经元对胃扩张刺激呈现剂量依赖性激活，表现为响应神经元数量增加及荧光响应强度增大，验证了NTS钙成像系统的功能性。接下来，作者通过最小二乘拟合对比共表达神经元的峰值响应发现，SomaFRCaMPi的整体峰值ΔF/F较RiboL1-GCaMP8s低约33%，但红色通道整体基线噪声显著更低：SomaFRCaMPi的基线噪声较RiboL1-GCaMP8s低约32%，因此，二者Z值近乎一致。这些结果表明SomaFRCaMPi具有更低的成像噪声，且灵敏度与高性能绿色胞体定位GECI相当。

图5. SomaFRCaMPi在体表达特性表征

图6. SomaFRCaMPi在体长期表达特性表征

结论

本研究中，作者通过整合拓扑倒置与胞体定位策略重新设计基于mApple的红色GECI，进而开发了首个公开报道的胞体定位红色GECI—SomaFRCaMPi，并在斑马鱼幼鱼共聚焦成像、清醒行为动物2P成像中在体评估其性能。研究结果显示，相同成像条件下，SomaFRCaMPi展现出更优的群体神经元钙信号记录性能。因此，SomaFRCaMPi可作为神经编码机制探究、环路可塑性研究等神经环路功能解析中的关键工具。

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