编者按

神经递质（NTs）和神经调质（NMs）在大脑功能和行为调控中起着关键作用，其动态变化的监测对于理解神经系统的工作原理至关重要。近年来，基因编码NT/NM指示剂（GENIs）的开发为实时监测NTs和NMs的动态变化提供了新的工具，推动了神经科学研究的进展。GENIs不仅能够提供健康和疾病状态下NTs和NMs的时空信息，还能揭示非经典NTs/NMs的释放机制，以及神经元与非神经元细胞之间的通信。小编在这里为大家推荐北京大学李毓龙教授团队发表在Nature Reviews Neurosciences上题为“Pushing the frontiers: tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators”的综述，该文全面总结了监测NTs和NMs动态变化的方法，重点介绍了GENIs的新进展及其在神经科学研究中的应用。文章详细探讨了GENIs的设计原理、特性、应用前景以及面临的挑战，并展望了其未来发展方向，为神经科学研究提供了重要参考和启发。

神经系统由神经元和胶质细胞等多种细胞组成，主要通过突触传递信息。在化学突触中，NTs和NMs从突触前细胞释放到突触间隙，与突触后细胞的受体结合。经典NTs如谷氨酸、GABA和乙酰胆碱（ACh）通过离子型受体和G蛋白偶联受体（GPCRs）快速激活或抑制突触后细胞，而NMs（如单胺类、核苷酸、神经脂质和神经肽）则通过GPCRs引发较慢、长程和扩散式的分子信号级联反应。这些化学性神经传递参与觉醒、注意力、感知和学习等生理过程，并与多种脑部疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等）密切相关。

因此，高时空精度监测细胞外NTs和NMs的浓度及其动态变化，对于理解健康和疾病状态下细胞间通信至关重要。正如孔子所说：“工欲善其事，必先利其器。”南非生物学家、诺贝尔奖得主Sydney Brenner也曾指出，科学的进步依赖于新技术的开发。如今，我们正处于一个能够以全新的时空分辨率追踪NTs和NMs的新时代。下面首先回顾了一系列非遗传编码的方法。

非基因编码方法：电生理学、微透析与电化学技术

非基因编码方法在NTs和NMs的研究中具有重要应用。电生理学方法通过离散电极获取信息，但其技术要求高、通量低且主要用于体外研究。另外，电生理学的读出信号（电流或膜电位）缺乏特异性，需用受体拮抗剂验证分子特异性。此外，尽管电生理学技术可提供亚毫秒级的时间分辨率，但它无法直接测量释放动力学。不过，电生理学可以与直接检测方法结合，用于研究NTs和NMs的释放及其在靶细胞中的下游效应。

微透析技术则通过半透膜收集细胞外间隙的可溶性化学物质（如NTs和NMs），结合液相色谱或毛细管电泳等技术可实现纳摩尔甚至皮摩尔级别的检测灵敏度，并具有高分子特异性，适用于长期、连续监测。然而，微透析的时间分辨率较低，缺乏高空间分辨率（难以达到亚细胞水平）。此外，微透析作为一种相对侵入性的操作，可能损伤局部组织，引发胶质细胞增生，破坏血脑屏障完整性，且对神经肽和神经脂质的检测存在局限。

电化学技术，尤其是快速扫描循环伏安法（FSCV），结合碳纤维微电极，能够在亚秒级时间尺度上检测纳摩尔浓度范围内的电化学活性物质，如多巴胺（DA），并已成功应用于活体研究。FSCV具有较低的侵入性，适用于小动物模型和人类的活体检测。然而，FSCV难以区分在相似电位下发生氧化或还原反应的结构相似的化学物质（如DA和去甲肾.上腺素（NA）），且不适用于检测不易氧化的NTs或NMs，包括谷氨酸、GABA、ACh等。为此，研究者开发了酶修饰电极，通过酶促反应生成可检测的电活性产物（如过氧化氢）来间接检测这些物质。

尽管技术有所改进，但微透析和电化学测量的时间分辨率和分子特异性仍较低，难以用于单细胞或亚细胞水平的NTs和/或NMs的体内释放检测。

图1. 用于测量NTs和NMs的非遗传编码方法

非基因编码的光学工具

光学成像方法凭借高时空分辨率和低侵入性，成为检测NTs和NMs的重要工具。近年来，多种光学探针被开发，包括化学染料、细胞基传感器（如CNiFERs:基于细胞的神经递质荧光工程报告系统）和基于纳米材料的传感器。例如，nIRCat作为一种非基因编码的荧光纳米传感器，通过结合碳纳米管和寡核苷酸，实现了对儿茶酚胺的近红外检测，可在脑切片中监测DA释放，并与DA药理学兼容。其近红外波段（1000-1300 nm）支持与其他光谱兼容传感器的联合使用，实现多信号的同时检测。然而，nIRCat对DA和NA的区分能力有限，选择性有待提升。尽管光学成像方法具有显著优势，但非基因编码工具仍面临递送难题，且无法特异性检测特定细胞类型中的NTs和NMs。

基因编码方法

基因编码传感器可在特定细胞类型中长期表达，支持对NTs和NMs的持续成像。近年来，基因编码光学工具的开发为神经传递和神经元活动的成像提供了多样化工具，包括囊泡释放指示剂（如pHlourin、pHTomato、pHmScarlet）、神经肽释放报告器（NPRRs）、基因编码钙离子指示剂（GECIs，如GCaMPs和jRGECOs）、电压指示剂以及NT/NM指示剂。这些工具的设计、优化和验证策略，推动了GENIs的开发。以下将重点介绍GENIs的设计原理、特性、应用及局限性。

GENIs的设计原则和特性

GENIs已成为研究神经信号传递的重要工具，由配体结合模块和荧光模块组成，通过配体结合诱导构象变化来改变荧光信号。根据配体结合模块的不同，GENIs分为基于细菌周质结合蛋白（PBP）的传感器和基于GPCR的传感器。PBP传感器具有低亲和力和快速动力学特性，适用于检测谷氨酸、GABA、ATP等神经递质，但特异性有限。GPCR传感器则具有高特异性，可用于检测DA、ACh等NTs和NMs。通过荧光共振能量转移（FRET）或单荧光蛋白策略，GPCR传感器可实现高信噪比（SNR）检测。

基于GRAB策略开发的其他传感器（如GRAB5-HT、GRABeCB等）也已用于多种NMs的检测。然而，这些传感器在活体中检测内源性NT/NM动态变化的能力仍有待验证。未来，通过重新设计配体结合口袋和连接区域，结合天然神经递质结合蛋白的利用，有望开发出更宽动态范围、更高特异性和更少生理影响的新型GENIs。同时，基于荧光素酶的生物发光传感器也拓展了GENIs的工具箱，但其低光子产量限制了其在细胞水平成像中的应用。

图2. 用于测量NTs和NMs的遗传编码指标

表1. 基因编码单波长NTs和NMs指示剂

使用GENIs时的注意事项

随着GENIs的快速发展，其工具箱不断扩展，原本用于钙离子成像的设备和方法现可用于检测NTs和NMs信号。目前多种GENIs各有其亮度、动态范围、亲和力、选择性和动力学特性，但不存在“全能”传感器，需根据具体问题选择合适的工具。在选择GENI时，需考虑以下要点：

灵敏度：由动态范围、亲和力和亮度决定。在亮度和最大响应相当的情况下，高亲和力的GENI更适合生理条件下的NT/NM检测。SNR是评估GENI性能的重要指标，不仅取决于响应强度，还与基础亮度相关。例如，尽管dLight1.3b的最大响应高于GRABDA2m，但后者因基础亮度更高而具有更高的SNR。

选择性：例如，DA传感器虽优于FSCV，但仍可能对NA响应。研究DA动态时，需选择区分能力更强的传感器。

动力学特性：快速结合的GENI对短暂释放事件更敏感，而快速解离的GENI适合追踪快速变化的NT/NM动态。

药理学特性：GPCR基础的GENI可能对激动剂或拮抗剂响应，可用于验证信号来源，但也可能限制某些药理学操作。可通过选择不同GPCR亚型或基于PBP的传感器来解决这一问题。

此外，GENI的生物物理特性在体外易于表征，但在体内需通过多种成像方法验证其性能，如对光遗传或化学遗传刺激的响应。实验设计时还需考虑GENI对细胞生理的影响，例如GRABACh2.0可能影响下游信号传导，而优化后的GRABACh3.0减少了这种影响。最后，GPCR基础的传感器虽是工程化受体，但其表达模式可能与内源受体不同，仅能反映NT/NM释放，而不适合推断靶细胞上NT/NM感应的空间组织。为更准确地推断NT/NM感受的空间分布，可以在表达内源性受体的靶细胞中选择性地表达GENIs来实现。

图3. 遗传编码NTs或NMs指示剂的选择

GENIs的应用

GENIs将神经化学信号转化为荧光变化，因此任何能检测荧光强度变化的技术都可用于测量GENI信号。目前用于记录GENI信号的成像技术包括光纤光度法、宽场表观荧光成像、光片荧光成像、多光子成像和超分辨率成像。这些方法在空间和/或时间分辨率上各有优势，且仪器复杂性和成本差异较大，因此需根据具体研究问题选择合适的成像工具。

▶ 自由活动动物中GENI信号的检测

在自由活动动物中，光纤光度法因设备紧凑、操作简单，已成为检测GENI荧光信号的主要方法。它可测量几百微米范围内的整体荧光信号，但空间分辨率较低；采样率可达到数十到数千赫兹，时间分辨率通常不受限，但信号同步性会影响结果解释。光纤光度法已广泛用于检测多种NMs（如ACh、DA、NA、5-羟色胺（5-HT）、腺苷和内源性大.麻素（eCB））的动态变化，涵盖睡眠觉醒转换、自然行为、学习记忆和应激等多种条件。例如，腺苷水平在清醒和快速眼动（REM）睡眠期间较高，而在非REM睡眠期间较低；5-HT水平在清醒时较高，但在REM睡眠期间降低。这些研究揭示了NMs在睡眠与觉醒转换中的协同作用。此外，光纤光度法还用于研究DA在动机和奖赏相关行为中的作用。例如，药物成瘾和高脂饮食均能过度刺激DA系统，并导致对典型刺激的DA反应减弱。光纤光度法的技术改进（如多光纤光度法、无线光纤光度法和深度分辨光纤光度法）将进一步提升实验设计的灵活性。

自由移动的动物中使用的另一种流行的成像工具是微型表观荧光显微镜（miniscope）理论上可提供细胞分辨率，然而，由于GPCRs主要在细胞膜上表达，来自轴突和树突的高荧光信号使得难以区分单个表达NM传感器的细胞。未来，开发针对细胞特定区域的NM传感器可能使miniscope能够以亚细胞分辨率监测信号。此外，微型化双光子显微镜可提供高空间分辨率并减少背景信号，有望在自由活动动物中实现单细胞水平的GENI信号检测。

图4. 光纤光度法记录自由活动小鼠中NTs或NMs的动态变化

▶ 头固定动物中GENI信号的检测

在头固定动物中，由于样本静止，可使用更复杂的显微镜技术来检测GENI信号，这些技术主要关注大范围成像或高空间分辨率。

介观成像：通过显微镜耦合相机从大脑表面收集荧光信号，覆盖约100 mm²区域，空间分辨率为每像素数十微米，帧率为10-50帧/秒，适用于检测大多数GENI的动力学变化。

多光子成像：主要是双光子成像，通过红外光激发GENI，实现高空间分辨率（<1 mm），但视场范围较小（通常<1 mm²），时间分辨率也较低（采样频率通常在1-30 Hz之间）。

光片荧光显微镜（LSFM）：通过薄光片照亮目标平面，实现细胞分辨率下的三维体积成像，光毒性低，适合长时间成像

即在头固定动物中，介观成像适用于大范围、低分辨率的信号监测；多光子成像提供高空间分辨率，适合研究局部神经化学信号的动态变化；光片荧光显微镜结合大体积成像和低光毒性优势，适用于长时间监测和透明组织的成像。这些技术各具优势，可根据具体研究需求选择合适的工具。

图5. 清醒小鼠大脑皮层NTs或NMs动力学的宽视野介观成像

图6. 不同制剂和模式生物中NTs或NMs动力学的双光子成像

▶ GENIs的其他应用

GENIs不仅用于研究NTs和NMs的生理功能，还在多个领域展现出广泛应用潜力。例如，结合高分辨率成像技术，GENIs可用于研究NMs（如ACh和单胺）的释放和扩散机制，揭示其在小鼠脑切片中的扩散范围及体积性传递特性。在药物研发中，iNicSnFRs系列荧光传感器可用于检测烟.碱类药物的药代动力学，基于5-羟色胺2A受体的传感器PsychLight可用于预测致幻剂的幻觉效应，并识别具有抗抑郁效果的非幻觉类药物。此外，GENIs通过病毒介导可在多种物种的大脑中表达，可用于非传统模型生物（如斑马雀、草原田鼠）和非人灵长类动物的神经研究。总之，GENIs提供了一种高度灵活的工具集，可用于在多种物种中研究生理和病理条件下各种行为下的微观和宏观神经调节机制。

GENIs的局限性及进一步改进

GENIs虽然具有高时空分辨率，但过表达可能导致缓冲效应，干扰内源信号。因此，需要精确控制GENI的表达水平，同时优化现有方法以提高灵敏度。此外，与已鉴定的大量细胞外信号分子相比，现有的生物传感器种类仍显不足。未来需开发更多针对神经脂质、神经肽或其他神经信号的传感器，并拓展传感器的光谱范围。目前，大多数成像探针依赖荧光强度，只能定性监测NTs和NMs的相对变化。开发能够定量测量的新型传感器（如比率传感器）是未来的重要方向。同时，GENIs目前仅能检测细胞外NTs和NMs的存在，无法反映其下游效应。未来可将GENIs与电生理记录或钙成像技术结合，同时研究NTs/NMs的释放及其下游信号。此外，同时测量多种NTs和NMs将提供更全面的脑内通信信息。例如，NMs和NTs可能形成平行通信通道，其时间关系可能携带重要信息，需通过同时记录揭示。最后，基于结构的高通量筛选有望提高传感器开发的成功率。例如，获得GPCR基础传感器的原子分辨率结构，将加速传感器的优化和开发。

使用GENIs的未来方向

新开发的GENIs将助力研究NTs和NMs在细胞、组织和活体中的动态特性，揭示健康与疾病状态下其时空信息，解析非经典NTs/NMs（如脂质、核苷酸和神经肽）的释放和调节机制以及神经元与其他细胞（如胶质细胞、免疫细胞、内皮细胞和肌肉细胞）间的通信。鉴于GPCRs是研究最广泛的药物靶点家族，GRAB传感器可能为药物筛选和体内验证提供重要工具。未来，传感器开发者与用户需紧密合作以推动GENIs的优化。同时，GENIs只是众多前沿工具之一，其他工具（如光学传感器、光/化学遗传学、CRISPR–Cas9基因编辑等）可与GENIs结合，助力解析复杂系统中的化学信号，推动神经科学研究。

结论

尽管用于检测NTs和NMs的生物传感器领域发展迅速，但在传感器的灵敏度、选择性、动力学特性、药理学特性，以及成像技术和数据处理方法方面，仍存在提升空间。为实现这些目标，工具开发者和终端用户需携手共进，持续优化传感器性能并完善相关技术。