简介

钙成像技术（Calcium imaging）是一种利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度变化的高分辨率成像技术。通过荧光染料或者蛋白质荧光探针（钙离子指示剂，Calcium indicator）与钙离子结合后发出的荧光信号，实时监测细胞内钙离子的动态变化，反映细胞活动的状态。在神经科学研究中，钙成像技术被广泛应用于观察神经元的活动，该技术将原本难以察觉的神经活动转化为直观的动态影像，使科学家得以亲眼目睹神经信号在神经网络中的传递过程。自问世以来，该技术便备受全球神经科学家的青睐，至今仍是观测神经活动最直接、有效的方法之一。

基本原理

在生物有机体内，钙离子是关键的胞内信号分子，广泛存在于各种细胞类型中，并在多种生理功能中发挥重要作用，如心肌细胞的收缩控制、细胞周期的调节等。在哺乳动物的神经系统中，钙离子作为重要的神经元胞内信号分子，在静息状态下，神经元胞内钙离子浓度通常维持在50-100 nM。神经元活动时，胞内钙离子浓度可显著上升至10-100倍，这一变化对突触囊泡中神经递质的胞吐释放至关重要。神经元的活动与胞内钙离子浓度的动态变化密切相关，放电时会引发短暂的钙离子浓度高峰。钙成像技术利用钙离子指示剂，这些指示剂与钙离子结合后会发生构象变化，导致荧光强度的改变，从而将神经元中的钙离子浓度变化转化为可检测的荧光信号，实现对神经元活动的实时监测。

钙离子指示剂

目前，常用的钙离子指示剂分为两类：化学性钙离子指示剂和基因编码钙离子指示剂（GECI）

1.化学性钙离子指示剂

这类指示剂为能与钙离子结合的小分子化合物。众多此类指示剂以EGTA（乙二醇双四乙酸）的同系物BAPTA（氨.基.苯乙.烷四乙酸）为基础。BAPTA对钙离子的亲和力显著高于镁离子，使其成为钙离子螯合的常用选择。当前广泛使用的化学钙离子指示剂包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3和Fluo-4。

2. 基因编码钙离子指示剂

这类指示剂由绿色荧光蛋白（GFP）及其变体（例如，循环排列GFP、YFP、CFP）与钙调蛋白（CaM）及肌球蛋白轻链激酶M13结构域融合而成。目前，较为流行的基因编码钙离子指示剂有GCaMP系列、Pericams、Cameleons等。

几种常用的GECI

GCaMP6

GCaMP6是新一代的GCaMP蛋白，它的钙指示功能达到甚至超过了常用的化学钙指示剂。它有三种常用的亚型：GCaMP6s（慢）、GCaMP6m（中等）、GCaMP6f（快），其中对于钙离子的结合力，6s>6m>6f，所以6s最敏感，适合低频信号的指示，6f解离最快，适合高频信号的指示，6m结合活性适中，适用的范围最广。

jGCaMP7

jGCaMP7是GCaMP6的改进版本，jGCaMP7提供了对单个尖峰的改进检测（iGCaMP7s，f），神经突起和神经纤维网的成像（jGCaP7b），并且可能允许使用双光子（jGCaMP7s,f）或宽视场（iGCarP7c）成像来跟踪更大的神经元群。

CaMPARI2

CaMPARI2是一种光转换型钙离子指示剂，能够在紫外光照下从绿色变为红色，适用于长时间的钙信号记录和细胞追踪。

jRGECO1a
激发光波长红移mApp1e（jRGEC0la），红色GECI有助于深部组织成像，与GFP等报告基因共表达实现双色成像，也可用与光遗传学与钙成像搭配组合。

jRCaMP1

激发光波长红移mRuby（jRCaMPla，b），红色GECI有助于深部组织成像，与GFP等报告基因共表达实现双色成像，也可用与光遗传学与钙成像搭配组合。

RCaMP3

适合双光子成像激发波长1040 nm，大视野成像，荧光RFP，与jRGECO1a相比，RCaMP3具有更大的△F/F，荧光亮度更强。

GCaMP-X

GCaMP-X解决了核积累、急性和慢性Ca2+失调，转录信号传导和细胞形态异常等问题，同时仍表现GCaMP优良Ca2+感应部分。

XCaMPs

新一代四色GECI系统-XCaMP

jGCaMP8

jGCaMP8系列包括jGCaMP8s、jGCaMP8f、jGCaMP8m，具有快速动力学，其荧光信号上升时间比之前的GCaMP版本快近十倍。jGCaMP8s：高敏感，快速上升，缓慢衰减，比iGCaMP7s敏感2倍，比iGCaMP7f快2倍以上（1AP时）；jGCaMP8m:中等敏感，快速上升，中等衰减，上升时间比iGCaMP7f快近4倍，灵敏度高3.5倍。

 

钙成像技术在神经科学研究中的应用

监测神经元活动：通过检测神经元内钙离子浓度的变化，实时观察神经元的放电活动，了解神经元如何响应各种刺激。

研究神经网络：同时记录多个神经元的活动，揭示神经元之间的连接和信息传递路径，帮助构建神经网络模型。

探索神经环路功能：研究特定神经环路在不同行为和认知过程中的作用，例如在学习、记忆、情感和决策中的功能。

分析神经发育：观察神经元在发育过程中的活动变化，研究神经网络的形成和成熟过程。

研究神经系统疾病：通过比较正常和病理状态下的钙离子活动，揭示神经系统疾病的发病机制，如阿尔茨海默病、帕金森病等。

药物筛选和评估：评估药物对神经元活动的影响，筛选潜在的治疗药物，研究药物的作用机制。

 

钙成像技术应用案例

1、光纤钙成像系统记录到内脏疼痛刺激（CRD）可显著引起小鼠表达P2X3R的PVH-LSV投射神经元的强烈反应；躯体疼痛刺激（VFF）可显著引起小鼠表达VIPR2的PVH-ZIC投射神经元的强烈反应。

客户发表文章：Li, Yong-Chang et al. “Distinct circuits and molecular targets of the paraventricular hypothalamus decode visceral and somatic pain.” Neuron(IF=14.7) vol. 112,22 (2024): 3734-3749.e5. doi:10.1016/j.neuron.2024.08.024

使用我司钙成像病毒：AAV2/9-EF1a-D10-axon-GCaMP6s

注射部位：小鼠PVH

 

2、通过钙成像技术在体实时记录神经元GCaMP荧光变化，结果表明摄食甜水、与异性社交等奖赏性刺激选择性地激活小鼠BLA到同侧半球NAc的神经投射，而摄入苦水、面临危险等厌恶性刺激则选择性地激活小鼠BLA到对侧半球NAc的神经投射。

客户发表文章：Tian, Zhen et al. “The interhemispheric amygdala-accumbens circuit encodes negative valence in mice.” Science(IF=44.7) (New York, N.Y.) vol. 386,6722 (2024): eadp7520. doi:10.1126/science.adp7520

使用我司钙成像病毒：AAV2/9-EF1a-DIO-axon-GCaMP6f

注射部位：小鼠BLA

3、实验采用活体光纤钙成像技术，通过对小鼠胃部施加压力刺激，记录孤束核谷氨酸能神经元（NTS^Glu ）的钙活动。结果显示，胃部刺激显著增加NTS^Glu的钙荧光。进一步实验表明，膈下迷走神经切断（SDx）后，NTS^Glu对胃刺激的反应显著降低，而T5脊髓横断（T5x）无显著影响，提示反应主要通过迷走神经介导。

客户发表文章：Zhang, Fu-Chao et al. “A vagus nerve dominant tetra-synaptic ascending pathway for gastric pain processing.” Nature communications（IF=14.7） vol. 15,1 9824. 13 Nov. 2024, doi:10.1038/s41467-024-54056-w

使用我司钙成像病毒：AAV2/9-vglut2-GCaMP6s-EGFP

注射部位：小鼠NTS