胰高血糖素样肽-1受体（GLP1R）是一种肽激素靶点，在大脑的各个部位均有表达，尤其是在基底外侧杏仁核和下丘脑区域，并且在中枢神经系统以外的部位也有广泛表达。其内源性配体，胰高血糖素样肽-1（GLP-1），是一种在哺乳动物中完全保守的肽，主要由两种细胞类型产生：主要位于脑孤束核中的前胰高血糖素原（PPG）神经元，以及位于肠道中的肠内分泌细胞（ECs）。进食后，GLP-1会与胃肠抑制多肽（GIP）一起从肠道迅速释放到血液中，靶向胰腺的β细胞，并在高血糖条件下刺激胰岛素的产生和分泌。这种被称为“肠促胰素效应”的现象在代谢紊乱（如2型糖尿病）中受损，因此GLP-1信号通路成为治疗这些疾病的有吸引力的治疗靶点。除了其在控制饱腹感和食物摄入量方面的作用外，中枢GLP-1还被证明具有中枢神经保护作用，这表明其在人体生理学中具有多方面的作用。

人类的GLP1R（hmGLP1R）是药物筛选和药物开发的首要靶点，鉴于GLP-1受体激动剂（GLP1RAs）数十年来一直被用于2型糖尿病的治疗，近来已成为最为有效且广泛应用的减肥药之一。可用作GLP1R筛选工作的技术包括：通过基于放射性的检测或荧光标记的配体来监测配体与GLP1R结合的技术，以及能够监测GLP1R与下游信号通路偶联的技术，例如通过闪烁计数法、荧光法或生物发光共振能量转移检测。开发一种具有高灵敏度、分子特异性及时空分辨率的技术，以直接探测配体诱导的GLP1R构象活化，将极大地促进药物筛选工作，并有望拓展出许多重要的新应用领域。然而，目前此类技术尚缺。

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Tommaso Patriarchi与Nina Hartrampf在期刊eLife上发表了题为“Optical tools for visualizing and controlling human GLP-1 receptor activation with high spatiotemporal resolution”的文章，该研究利用已确立的蛋白质工程策略，设计并表征了一种基于GLP1R的新型遗传编码传感器，命名为GLPLight1。该传感器能够直接并实时地光学读取细胞内GLP1R的构象激活情况，研究通过确认其对GLP-1优于其他B1类G蛋白偶联受体（GPCR）配体的高特异性，对胰高血糖素的低亲和力，以及对GLP-1丙氨酸突变体的特异性功能缺陷，从而验证了GLPLight1在针对GLP1R的药物筛选实验中的潜力。最后，为进一步扩展光学工具包，该研究还开发了一种光控GLP-1衍生物（photo-GLP1），并将其与GLPLight1结合使用，以实现GLP1R激活的全光学控制和可视化。总之，本研究引入的新型全光学工具包，提供了以高时空分辨率深入探究GLP1R激活机制的有力手段，从而为在各种条件和系统下详细探究GLP1R的生理和药理调节机制提供了空前的机遇。

1、GLPLight1的开发及其体外表征

为了开发基于hmGLP1R的遗传编码传感器，研究者首先将hmGLP1R的第三个胞内环（ICL3）替换为多巴胺传感器dLight1.3b的cpGFP（循环排列的绿色荧光蛋白）模块，替换位置在氨基酸残基K336和T343之间。但初版传感器在细胞表面表达不佳，对GLP-1饱和浓度（10 µM）的荧光响应微弱（ΔF/F0=39%）。去除内源性GLP1R N端分泌序列（氨基酸1-23）后，膜表达和对GLP-1的荧光响应得到改善（ΔF/F0=107%）。接着，研究者对传感器的第二内环（ICL2）的赖氨酸残基进行扫描，发现L260K突变使传感器的动态范围翻倍（ΔF/F0=180%）。进一步的位点饱和突变筛选出一个新变体（包含K336Y和T343N突变），其ΔF/F0约为341%。为了提高传感器的表面表达，研究者在该变体上引入了一个C末端内质网导出序列。此外，在cpGFP片段中引入了三个突变，提高了探针的基础亮度而不影响其动态范围。最后，研究者突变了C末端负责GLP1R内化的八个磷酸化位点，以最大限度减少传感器内化。最终得到的传感器变体表现出良好的膜表达和与GLP-1结合时528%的最大荧光响应。该变体被命名为GLPLight1，并被选为进一步表征的对象。

为了验证GLPLight1作为研究hmGLP1R的新工具的实用性，研究者首先在体外对其特性进行了表征。他们通过腺相关病毒（AAV）转导将GLPLight1表达在培养的原代皮层神经元中，两周后，GLPLight1在神经元膜上表达良好，并对GLP-1（10 µM）表现出456%的最大响应。随后，研究者在HEK细胞（人胚肾细胞）中测量了传感器的光谱特性，这些特性与绿色G蛋白偶联受体（GPCR）传感器的光谱特性相似，显示出在500 nm附近的峰值激发、512 nm附近的峰值发射和425 nm附近的等吸光点。接下来，作者比较了传感器GLPLight1及其亲本受体（野生型GLP1R，WT GLP1R）与下游信号的偶联。通过分裂纳米荧光素酶互补实验，发现GLPLight1与所有测试信号伴侣的耦合显著降低。进一步的环磷酸腺苷（cAMP）信号实验表明，GLPLight1未能像野生型GLP1R那样有效诱导细胞内cAMP增加。这些结果表明，GLPLight1不太可能与内源性细胞内信号通路偶联。

2、GLPLight1作为药物筛选工具的应用

GLPLight1是一种新型的基因编码传感器，能够敏感地以强度测量的方式读取hmGLP1R对其内源性配体的激活情况。为确保其作为筛选工具的实用性，作者通过GLP-1与拮抗肽的竞争实验，检验了传感器响应的可逆性：向表达GLPLight1的HEK293T细胞依次加入1.0 µM GLP-1和10 µM exendin-9（Ex-9，一种众所周知的GLP1R拮抗肽），结果显示，Ex-9能在体外5分钟内部分逆转信号至最大GLP-1响应的42%。随后，作者测试了两种临床上用于抗肥胖的已知GLP1R激动剂——利拉鲁肽（Liraglutide）和司美格鲁肽（Semaglutide），是否能触发传感器的响应。结果显示GLPLight1对这两种药物的响应几乎与GLP-1相当。表明其可作为直接读取药物对hmGLP1R作用的工具。

鉴于GLP-1、GLP-2和胰高血糖素均源自共同的前体蛋白前胰高血糖素原（PPG）的蛋白水解加工，作者研究了传感器对这些其他肽的特异性。实验发现，传感器对GLP-2的荧光响应未检测到任何显著增加，但对胰高血糖素的响应产生了324%的ΔF/F0（占GLP-1最大响应的61%）。为进一步表征GLPLight1对其内源性激动剂的敏感性，作者在HEK293T细胞中进行了GLP-1和胰高血糖素的滴定实验，结果显示GLPLight1对GLP-1的亲和力比胰高血糖素高94倍。此外，在原代神经元中测得的GLP-1亲和力（EC50=9.3 nM）与在HEK细胞中的相似。另外，GLPLight1对在高浓度（1.0 µM）下测试的一系列其他内源性B1类GPCR肽配体（包括GIP（葡萄糖依赖性促胰岛素多肽）、CRF（促肾上腺皮质激素释放因子）、PTH（甲状旁腺激素）、PACAP（垂体腺苷酸环化酶激活肽）或VIP（血管活性肠肽））均无响应。

为了进一步验证GLPLight1的荧光响应是否与GLP1R激活的经典药理学读数一致，研究者合成了GLP-1的四个单残基丙氨酸突变体，并在GLPLight1表达细胞上进行滴定实验。结果表明，这些突变对最大传感器响应（Emax）和配体的效力（EC50）有明显影响，与文献报道的结果相符。即GLPLight1的荧光响应可用于研究GLP1R配体的Emax和效力相对趋势。最后，研究者还探讨了GLPLight1在体外检测内源性GLP-1释放的潜力。通过将表达GLPLight1的HEK293T细胞与GLP-1/胰高血糖素分泌的永生化肠内分泌细胞（ECs）共培养，发现GLPLight1能部分预激活，表明其能够检测到ECs分泌的内源性GLP-1。这为使用GLPLight1作为筛选工具，研究调节ECs分泌GLP-1的内在/外在因素提供了可能。

图2. GLPLight1的药理特性

表1. GLP-1肽的丙氨酸扫描变体的滴定参数（Emax和pEC50值是通过每种肽的四参数非线性拟合得出的，而EC50的位移则是通过与同时测量的野生型GLP-1肽进行比较得出的。）

 

3、Photo-GLP1的制备及体外表征

为了研究GLP1R和GLPLight1的时空激活特性，作者构想了一种光控GLP-1衍生物（photo-GLP1）。为确保photo-GLP1在释放前（即暗态下）不激活GLP1R或GLPLight1，光控基团必须位于GLP-1结合所必需的区域或其附近（肽的光控可通过在肽的侧链功能基团、主链酰胺或在肽的C端或N端连接光控分子来实现）。GLP-1主要通过其N端与GLP1R结合。因此，作者探索了N端光控策略以生成photo-GLP1。为确认photo-GLP1在紫外线照射下能释放野生型GLP-1，将photo-GLP1在LED光(λ=370 nm, 0.64 mW/mm2)下空气冷却照射20 min后，经液相色谱-质谱联用（LCMS）和超高效液相色谱（UHPLC）分析，photo-GLP1完全被分离得到WT GLP-1。随后，作者利用GLPLight1建立了一种全光学检测方法，用于表征体外光控GLP-1的释放过程。通过向表达GLPLight1的HEK293T细胞培养液中加入photo-GLP1并暴露于405 nm激光（紫外线）实现光控释放，同时用488 nm激光监测传感器荧光。无紫外线照射时，photo-GLP1无功能活性；而经10 s紫外线照射后，GLPLight1荧光显著增强，表明GLP-1成功释放并激活了传感器。延长照射时间可增强响应，最大测试释放时间（100 s）触发了传感器约30%的最大响应。且用GLP1R拮抗剂Ex-9预处理可显著减弱光控释放（100 s）引起的传感器响应。这些结果表明，使用405 nm光可有效控制photo-GLP1的体外释放，进而调控hmGLP1R的激活。

4、GLP1R活性的高分辨率全光学可视化与控制

在进行photo-GLP1的释放实验时，研究者发现传感器对培养液中GLP-1的响应在有无photo-GLP1存在时存在差异。进一步研究表明，photo-GLP1能显著影响GLP1R的激活动力学，降低激活速度，这可能是通过其与受体的细胞外结构域（ECD）结合，从而与功能活性的GLP-1竞争。接下来，研究者探讨了利用GLPLight1获取photo-GLP1释放后GLP1R激活程度的空间信息的可能性。通过在较大视野内三个不同区域（各约400 µm²）进行photo-GLP1的光学释放实验，结果显示GLPLight1在释放区域表现出荧光响应，而视野内其余部分的荧光保持不变，具有高度空间定位性。为确定该检测中的传感器读数是否能以亚细胞分辨率报告GLP1R的激活情况，作者选择了约16 µm²的释放区域直接位于细胞膜上重复了释放实验。结果显示，紫外线照射导致GLPLight1的局部激活，仅限于细胞膜的一部分，并未扩散至邻近细胞。这些结果表明，GLPLight1的光学特性使其能精确确定GLP1R激活的空间范围，甚至达到亚细胞域级别。

最后，研究者测试了photo-GLP1的释放是否可用于控制hmGLP1R激活后的功能信号。为此，他们使用了一种新开发的基因编码cAMP传感器（G-Flamp1），cAMP是GLP1R激活后细胞信号传导的主要第二信使。在对共转染hmGLP1R和G-Flamp1的HEK293T细胞进行photo-GLP1释放后，仅在释放区域正下方的细胞中观察到cAMP传感器信号显著增加。这些结果表明，光控GLP-1的释放可以用于以高时空分辨率光学控制GLP1R信号激活。

总结

本研究开发了一种基于hmGLP1R的基因编码传感器GLPLight1。该工具具备高灵敏度和优异的时空分辨率，能够直接、实时地检测受体在配体诱导下的构象激活。尽管传感器似乎不适合检测GLP-1通过内分泌信号在周围环境中达到的浓度范围，但在特定脑区或靠近肠道肠内分泌细胞的地方，GLP-1的释放水平可能足够高以被GLPLight1检测到。未来研究可尝试在体内使用GLPLight1，结合AAV介导的表达和光纤光度测量等技术，进一步探索GLP-1释放动态与生理或病理条件的关系。此外，该研究还利用GLPLight1表征了photo-GLP1的释放过程，发现其能以单细胞或亚细胞分辨率控制GLP1R依赖的下游细胞信号传导。尽管photo-GLP1在体内应用时可能受DPPIV（二肽基肽酶IV）降解的影响，但仍有望在脑组织的神经生物学研究中应用，因为脑中DPPIV水平显著低于外周器官。

总之，该研究开发并应用了一套新的全光学工具包，揭示了GLP-1/GLP1R系统之前无法触及的空间维度。这些工具可以广泛应用于多种场景，其中一些已在本研究中展示，以增进我们对GLP-1/胰高血糖素/GLP1R信号系统在生理学中作用的理解，促进针对GLP1R通路的药物筛选与开发进程。

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