肝脂肪变性是最常见的慢性肝病之一，在过去几十年里，全球肝脂肪变性的患病率和发病率一直在上升。肝脂肪变性的发病机制复杂且尚不完全清楚，但胰岛素抵抗（IR）被认为是其发展的主要致病因素。在生理状态下，胰岛素抑制肝脏葡萄糖异生，促进脂肪从头合成（DNL）以储存热量。在IR期间，胰岛素不能抑制肝脏葡萄糖的产生，肝脏DNL仍无限制地增加，胰岛素水平与肝脏脂质沉积之间也存在正相关关系，进而造成肝脂肪变性增加。但肝脂肪变性通过何种机制增加仍未完全明确。

近日，山东省立医院赵家军、薄涛、高聆共同通讯在Nature Metabolism发表了题为“Upregulation of WDR6 Drives Hepatic de novo Lipogenesis in Insulin Resistance in Mice”的研究论文，作者发现WD重复域6（WD repeats domain 6，WDR6）促进IR期间肝脏DNL。人WDR6蛋白是含有WD40重复（WDR）的蛋白，由40-60个氨基酸残基组成的WD40重复是保守的蛋白结构域，其基本功能是协调多种蛋白复合物的组装。本文中，研究人员发现WDR6在高脂饮食（HFD）诱导的IR期间表达上调，随后通过上调脂肪酸（FA）合酶（FASN，参与肝脏DNL的关键代谢酶）表达促进肝脏DNL。此外，还鉴定出一个能抑制WDR6与PPP1CB（丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的β型催化亚基，PP1）相互作用的小分子天然化合物XLIX，从而能够减少IR期间的肝脂肪变性。综上所述，这些结果表明WDR6可作为治疗肝脂肪变性的潜在靶点。

1.胰岛素抵抗期间，WDR6表达上调以响应胰岛素

研究人员通过HFD喂养6周来构建IR小鼠模型，随后腹腔注射胰岛素（每天每kg体重注射0.75单位）。AKT的磷酸化水平（Ser473位点）是胰岛素信号通路的关键指标（胰岛素作用的“经典”下游分子），结果显示对胰岛素的反应降低（p-AKT水平较低），表明胰岛素抵抗形成。然而，FASN在HFD小鼠中继续显示出对胰岛素的相同反应（IR+insulin组小鼠肝脏FASN表达进一步增加）。结果表明，胰岛素仍然可驱动IR期间这种脂肪生成基因的表达。

为鉴定在IR状态下仍对胰岛素有反应的基因，研究人员对注射胰岛素及对照vehicle（BSA，牛血清白蛋白）的IR小鼠肝脏进行转录组分析，总共鉴定出263个差异表达基因（DEGs）。接下来利用公共基因表达谱数据库进一步筛选感兴趣的候选基因，发现310个基因在三个数据库中相交，并与FASN水平呈正相关。然后关注那些IR期间对胰岛素有反应的基因，从而选择了8个候选基因。最终，通过RT-qPCR实验及文献检索，确定WDR6作为进一步研究的靶点。作者进一步实验发现IR后注射胰岛素或HFD重新喂养6小时，WDR6水平升高。此外，还发现NAFLD（非酒精性脂肪肝病）小鼠（HFD喂养28周）肝脏WDR6表达增加，这支持了WDR6参与肝脏脂质代谢的假设。

图1. WDR6在IR状态下对胰岛素的反应为表达上调

2.敲低肝脏Wdr6减少胰岛素抵抗状态下的肝脂肪变性

为测试WDR6是否促进IR诱导的肝脏代谢紊乱，研究人员将选择性敲低肝脏Wdr6的腺相关病毒及对照AAV尾静脉注射到小鼠体内，注射4周后，小鼠HFD喂养8周。结果显示，AAV主要表达在肝脏，shWDR6小鼠肝脏Wdr6表达显著降低。有趣的是，在HFD喂养后，shWDR6小鼠免受代谢异常的影响，包括血清甘油三酯（TAG）和空腹血糖（FPG）水平轻度增加（HFD喂养的shNC小鼠TAG及FPG指标上调更多），胰岛素敏感性也得到改善。根据对肝脏的超声分析、油红O（ORO）染色、透射电子显微镜（TEM）观察和TAG含量测定，发现与shNC组小鼠相比，雄性shWDR6小鼠的肝脏脂质沉积有所改善。这些数据表明WDR6参与肝脏脂质代谢。

为明确靶向肝脏WDR6是否可改善HFD的不利影响，研究人员开发了治疗模型（TM）：HFD喂养2周后10周龄小鼠注射AAV-shWDR6（TM-shWDR6组），以模拟靶向WDR6的治疗效果。对照组小鼠（2周HFD+注射AAV-shNC）被细分为两个亚组：一组在注射AAV-shNC后继续接受HFD喂养（TM-shNC组），而另一组则在AAV注射后改为正常饮食（CD）喂养（HFD withdrawal组）。结果显示与TM-shNC组相比，TM-shWDR6组HFD诱导的IR和肝脏脂质沉积减轻。此外，作者也利用CRISPR-Cas9技术构建了肝脏特异性Wdr6敲除（WDR6-LKO）小鼠，对照组为野生型（WT）同窝对照（LC）小鼠。研究人员将8周龄WDR6-LKO和LC小鼠给予HFD喂养16周，结果显示相比于LC小鼠，雄性WDR6-LKO小鼠的血清TAG和FPG水平降低，胰岛素敏感性也有所提高；WDR6-LKO组小鼠肝脏中TAG沉积减少，脂肪肝程度较低。这些结果表明，靶向肝脏Wdr6可减少HFD相关的肝脏脂质沉积。综上所述，肝脏特异性抑制Wdr6改善或逆转IR期间的代谢紊乱，尤其是肝脏脂质沉积。

图2. Wdr6的肝脏特异性干预有效防止了HFD诱导的IR期间肝脏TAG过度沉积

3.肝脏WDR6通过调节脂肪从头合成影响肝脏甘油三酯沉积

接下来，作者对CD和HFD分别喂养8周的shWDR6和shNC小鼠肝脏（即shNC CD组、shWDR6 CD组、shNC HFD组、shWDR6 HFD组）进行了脂质组学分析，以深入了解可能受WDR6影响的脂质代谢途径。结果如图所示，HFD喂养组之间差异最大的代谢物是TAG。因此，研究人员评估了shWDR6和shNC小鼠参与肝脏TAG代谢主要途径（包括DNL、脂肪分解、游离脂肪酸氧化和摄取，以及葡萄糖代谢）的各种代表性基因的表达模式，结果表明HFD组中shWDR6小鼠的DNL相关基因Fasn在mRNA和蛋白水平上表达都低于shNC小鼠。此外，在HFD组中，与对照小鼠相比，Wdr6敲低后FASN酶活也更低。

为进一步证实这些发现，作者利用碳同位素标记分析对原代肝细胞（肝细胞来自Wdr6全身敲除小鼠（WDR6-WKO）和野生型（WT）对照小鼠）中新合成的棕榈酸（棕榈酸是FASN的产物）含量进行了估算，结果显示与对照组小鼠比较，WDR6-WKO小鼠肝细胞中13C标记棕榈酸含量明显更低。进一步借助碳-11乙酸盐正电子发射断层成像（PET）估算肝脏DNL速率，结果显示由于肝脏Wdr6的敲低，肝脏DNL速率降低。此外，由于TAG的侧链由各种FAs组成，根据所涉及的不同生物合成酶，研究人员发现差异最明显的FAs是饱和脂肪酸（FA16:0，FA18:0）和单不饱和脂肪酸（FA16:1，FA18:1），而它们分别是FASN或硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）的产物。综上所述，这些结果表明，IR状态下WDR6促进肝脏DNL，Fasn是参与这一过程的关键靶点。

接下来，作者测试了WDR6是否可介导IR期间调控FASN的胰岛素过程，因此，HFD-shWDR6小鼠注射胰岛素并在6小时后实施安乐/死。结果显示，与HFD-shNC小鼠不同，Wdr6的敲低显著减弱了胰岛素增加FASN水平的能力，但对乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）或SCD1的影响很小，这表明在IR期间，WDR6的上调可作为胰岛素增加FASN水平和DNL的替代手段。

为验证WDR6与肝脏DNL的关系，作者构建了高果糖饮食（HFrD）小鼠的AAV-shWDR6模型，由于果糖是肝脏DNL的强底物，HFrD在肝脏DNL研究中更常用。结果表明与HFrD-shNC组比较，HFrD-shWDR6组显示胰岛素敏感性有所增加，而血清TAG/FPG水平没有明显变化；肝脏饱和FAs（即DNL的产物）丰度更低；肝脏FASN水平降低。总的来说，这些数据证实WDR6在调节肝脏DNL中起着至关重要的作用。

随后，作者想知道WDR6是否介导了Fasn依赖于胆固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c，DNL的关键转录因子）的表达调控。于是，研究人员在12周龄SREBP1c-KO C57BL/6小鼠通过尾静脉注射腺病毒过表达Wdr6（间隔5天共注射3次），15 d后小鼠予以安乐/死。结果显示，虽然SREBP1c敲除可减少肝脏TAG沉积，但过表达Wdr6仍然可提高SREBP1c-KO小鼠肝脏TAG和FASN蛋白水平。这些结果表明，SREBP1c于WDR6介导的对Fasn表达和肝脏TAG沉积的调节作用而言很重要，但不是必需的（删除SREBP1c只能部分阻断WDR6介导的调节作用）。

4.XLIX抑制WDR6-PPP1CB相互作用并减少肝脂肪变性

作者接下来继续探索WDR6调节FASN表达的机制。研究人员发现WDR6与PPP1CB相互作用，并在其Thr316处使之去磷酸化。进一步研究发现PPP1CB-Thr316介导WDR6对Fasn转录的调节；WDR6通过FKSRSR基序与PPP1CB相互作用；WDR6通过与PPP1CB的相互作用促进PPP1CB在Thr316位点的去磷酸化，进而使WDR6介导的肝脏DNL调节发生。

在WDR6的结构域中，最大的结合口袋位于结构域b（氨基酸330-687），其中包含推测的PP1结合基序FKSRSR。研究人员通过分子对接筛选了来自绞股蓝的11种单体与WDR6口袋的结合能力，发现XLIX与WDR6的结合能力最强。分子动力学（MD）模拟表明，XLIX通过与多个氨基酸残基形成的多个氢键与WDR6相互作用良好，其接近FKSRSR基序，可能对WDR6和PPP1CB的相互作用产生空间位阻效应。为进一步研究结合模式，作者借助计算机进行了蛋白-蛋白对接以构建WDR6-PPP1CB复合物，然后对其MD模拟。结果表明，WDR6中推测的PP1结合基序FKSRSR（残基342-347）形成一个可插入PPP1CB口袋的环。在WDR6-XLIX复合物中，FKSRSR环的构象在与XLIX结合后发生了显著变化。因此，作者推测XLIX引起的变构效应可能破坏FKSRSR环与PPP1CB的相互作用。这种干扰促使研究者探索XLIX对体内肝脏脂质沉积的影响，首先，8周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射XLIX（每天每kg体重注射40 mg，持续4周；腹腔注射后1h即可到达肝脏）后通过评估肾功能和肝功能判断药物安全性，结果显示，XLIX对小鼠肝肾功能均没影响。肝肾切片的H&E染色结果进一步证实。

接下来，研究人员测试了XLIX是否可改善肝脏脂质沉积。考虑到NASH（非酒精性脂肪性肝炎）是临床需求最未被满足的病理状态，作者选择在HFD诱导的NAFLD模型及高脂高胆固醇（HFHC）饮食诱导的NASH模型中分别给予XLIX处理。于是，作者将小鼠予以HFD喂养3周（2周的HFD已足以诱导高水平肝脏脂质沉积）后腹腔注射XLIX 4周，结果显示，与对照组（注射DMSO）相比，XLIX处理组胰岛素敏感性提高。此外，肝脏脂质沉积和TAG含量降低，p-PPP1CB表达增加，FASN蛋白水平降低。对于NASH模型，8周龄C57BL/6J小鼠以HFHC饮食（HFHC组）或标准对照饮食（NC组）分别喂养2w、4w、8w、16w，结果显示，HFHC组小鼠肝脏WDR6表达显著增加（4w、8w、16w），并伴随NASH的病理进展（由肝脏切片的H&E、油红O和天狼星红-Picrosirius red染色结果揭示），p-PPP1CB表达明显下调（8w、16w）。在HFHC饮食喂养16周后腹腔注射XLIX 4周，结果表明XLIX的处理使得HFHC组小鼠IR程度更低（胰岛素敏感性提高）。更重要的是，该组小鼠肝脏脂质沉积和TAG含量也减少；p-PPP1CB表达增加。此外，多个标记基因的表达也降低了，如促炎相关基因IL1b、IL6和Tnf以及促纤维化基因Col1a1、Col3a1和编码蛋白α-SMA的Acta2。这些数据表明，XLIX能减缓肝脏炎症和纤维化的进展。综上所述，这些结果表明，XLIX很可能以增强PPP1CB在Thr316位点的磷酸化的方式改善NAFLD和NASH的进展。

结论

在这项研究中，作者发现了以前未被报道的肝脏DNL关键调节因子WDR6。在IR期间，肝脏WDR6表达上调并通过诱导PPP1CB的去磷酸化来促进肝脏DNL，从而导致Fasn表达增加。WDR6的进一步遗传或药理学靶向可有效减少与IR相关的肝脏TAG沉积。

这项工作得到了国家自然科学基金项目（项目批准号：91957209、81770788、82130025、82200879）、泰山学者项目等经费支持。

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