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文献解读

【AAV在眼科疾病中的应用】客户文章:骨形态发生蛋白BMP4在青光眼中发挥保护作用的机制—武汉大学人民医院沈吟教授团队揭示

2024-07-01  阅读量:80

青光眼是世界范围内视力下降和失明的主要原因。眼压(IOP)升高是青光眼的主要风险因素,会导致视神经损伤和神经退行性变。世界上最常见的青光眼类型是开角型青光眼。在原发性开角型青光眼(POAG)中,小梁网(TM)的形态和生物化学变化产生病理变化,进而增大房水(AH)阻力并促进眼压升高。转化生长因子-β2(TGF-β2)通过使TM中细胞外基质(ECM)的产生增加从而在POAG的发病机制中发挥相当大的作用。骨形态发生蛋白(BMPs)属于TGF-β超家族,并对其它TGF-β家族成员表现出拮抗作用。据报道BMP4抑制TM中ECM分子的合成从而改善青光眼中AH流出并降低IOP。这些发现支持了BMPs作为青光眼潜在治疗靶点的研究

近期研究表明BMPs在急性损伤和神经退行性疾病视网膜中上调表达,如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤模型。此外,已有研究证明NMDA介导的损伤下,外源性添加的BMP4通过磷酸化Smad同源物(Smad1/5/8)促进视网膜神经节细胞(RGCs)的存活。在视神经挤压(ONC)小鼠模型中,BMP4的应用对RGCs产生了神经保护和轴突再生作用。然而,目前尚不清楚BMP4能否在青光眼视网膜中发挥类似的保护作用

近日,武汉大学人民医院沈吟教授团队在Experimental Eye Research期刊在线发表了题为“Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma”的研究论文。该研究旨在确定青光眼中BMP4可能的治疗效果。研究人员通过前房内注射磁珠悬液的方法诱导实验性青光眼小鼠模型,发现慢性眼压升高上调了BMP4及其Ia型受体(BMPRIa)的表达。玻璃体腔注射重组腺相关病毒(rAAV)诱导的BMP4过表达显著提高了RGCs的存活率,并恢复了视网膜电图(ERG)中明视负波反应(PhNR,指示RGCs功能)的幅度。此外,通过类脊索蛋白1/CHRDL1(研究显示CHRDL1通过与BMP4结合而充当BMP4的内源性拮抗剂)过表达阻断BMP4信号,导致RGCs的存活数量减少,ERG中缺少PhNR反应。总的来说,这项研究表明,在实验性青光眼小鼠模型中,BMP4过表达促进了RGCs的存活并恢复了RGCs功能。因此,BMP4可能成为预防青光眼神经退行性变的新靶点



1.实验性青光眼小鼠模型中BMP4及其下游调节因子表达上调

前房内注射磁珠是一种公认的青光眼动物模型造模方法,可将高眼压维持在20-25 mmHg数月。该模型可用于观察慢性高眼压引起的损伤。研究人员构建青光眼动物模型,HE染色显示前房角聚集大量磁珠。与PBS组相比,磁珠组的IOP在12周后仍可稳定地维持在高水平。注射磁珠后1、2和3个月分别取视网膜,RT-qPCR分析显示,BMP4、BMPR1a和BMPR1b的mRNA表达水平在实验性青光眼小鼠中均上调。与PBS组相比,注射磁珠后1个月BMP4 mRNA表达水平增加了4倍;但在注射磁珠后2个月及3个月,观察到其mRNA表达水平轻微下调。BMPR1a的mRNA表达水平提高了约20倍(注射磁珠后1个月)。Smad1、5和8是BMP4的经典下游介质。值得注意的是,这些介质的mRNA表达水平也上调。与PBS组相比,Smad1 mRNA表达水平在注射磁珠后1个月上调了5倍。前人研究显示CHRDL1是BMP4的天然抑制剂;其表达在注射磁珠后1个月升高,然后降至正常基线水平。


图1. BMP4及其下游调节因子在实验性青光眼模型小鼠中表达上调


2.过表达BMP4提高RGC细胞存活率

接下来,为鉴定BMP4在实验性青光眼小鼠模型中的功能,研究人员过表达BMP4并通过过表达CHRDL1抑制BMP4。由于BMP4肽在体内快速降解,于是选择重组腺相关病毒AAV2/2载体玻璃体腔注射的方式以产生BMP4或CHRDL1的长期稳定激活。AAV注射后1周建立实验性青光眼模型,结果显示EGFP报告基因在RGCs和视神经纤维中广泛表达;37.16%的RGCs与EGFP共定位。BMP4过表达后,视网膜中BMP4高表达持续至少3个月。随后作者检测过表达BMP4对青光眼模型小鼠RGC细胞存活率的影响。注射磁珠后4周,利用RGCs特异性标志物Brn3a(量化RGCs数量)的视网膜铺片免疫荧光染色显示,与PBS组比较,磁珠组RGC细胞丢失的比例约为22.07%;磁珠+AAV-EGFP组RGC细胞丢失的比例约为23.76%。与磁珠组相比,磁珠+AAV-EGFP组的RGC细胞丢失没有显著差异。磁珠+AAV-BMP4组RGC细胞丢失的比例约为13.88%。相比于磁珠+AAV-EGFP组,磁珠+AAV-BMP4组的RGCs存活率增加了41.59%,表明BMP4在IOP升高型青光眼模型中具有显著的保护作用。此外,与磁珠+AAV-BMP4组比较,磁珠+AAV-CHRDL1处理却加重了RGCs的变性,导致RGC细胞丢失的比例明显升高。青光眼的病理特征是RGCs存活率下降和轴突变性,进而导致神经纤维层(NFL)和内丛状层(IPL)厚度变薄。研究表明,视网膜内层(由NFL、神经节细胞层(GCL)和IPL组成)的厚度对青光眼的诊断有很好的帮助。研究人员利用HE染色观察视网膜厚度,结果显示BMP4的过表达导致NFL和IPL厚度的损失显著减少,而CHRDL1的过表达逆转这种作用。


图2. 玻璃体腔注射AAV2/2过表达BMP4表达模式




图3. BMP4的过表达提高了实验性青光眼小鼠模型中RGCs的存活率



3.过表达BMP4提高ERG中PhNR幅度

接下来,作者通过ERG记录探究磁珠注射后8周BMP4是否影响视觉功能。结果提示磁珠组PhNR幅度降低,表明实验性青光眼小鼠的RGCs功能受损。与磁珠+AAV-EGFP组相比,磁珠+AAV-BMP4组PhNR幅度显著提高。相比之下,CHRDL1处理大大降低了PhNR的幅度。因此证明BMP4的过表达对实验性青光眼小鼠PhNR幅度的下降具有保护作用。即过表达BMP4改善青光眼小鼠的视觉功能。

图4. 过表达BMP4改善青光眼小鼠的视觉功能

 

4.过表达CHRDL1通过抑制BMP4/pSmad1/5/8信号加重RGCs变性

接着,研究人员探究CHRLD1是否通过抑制BMP4信号来发挥对RGCs的作用(增加RGCs凋亡)。结果显示,磁珠+AAV-BMP4组pSmad1/5/8水平显著增加,而相反磁珠+AAV-CHRLD1组pSmad1/5/8水平明显减少。一些研究表明,胶质细胞活化和炎症反应在青光眼的病理机制中起着重要作用。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是视网膜中Müller细胞的主要标志物。GFAP的表达在磁珠组中显著上调,而在磁珠+AAV-BMP4组中下调(磁珠+AAV-CHRLD1组中明显上调)。这些结果表明,CHRDL1的过表达通过抑制BMP4/pSmad1/5/8信号来加重RGCs变性。BMP4/Smad1/5/8通路的作用机制可能与抑制胶质细胞活化有关。

 

结论

综上所述,在实验性青光眼小鼠模型中,玻璃体腔注射表达BMP4的AAV显著提高了RGCs的存活率,同时,BMP4也恢复了PhNR反应的幅度。BMP4的神经保护和恢复作用表明,它可能成为预防青光眼神经退行性变的新靶点。

 

武汉大学人民医院眼科中心沈吟教授为本文通讯作者Liu Dongmeia、Deng Qinqin共同第一作者。该项工作得到了国家重点研发计划项目(2017YFE0103400)、国家自然科学基金项目(81470628,81800872)的支持。

 

通讯作者介绍:

沈吟,武汉大学人民医院眼科中心教授、三级主任医师、博士生导师。主要从事视网膜眼底病的临床和科研工作,近年来重点关注视网膜相关疾病的干细胞治疗和遗传性眼病的基因诊疗。主持国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项1项(510万),国家自然科学基金项目3项,其他省市级科研和人才项目共18项。已发表学术论文118篇,其中SCI文章74篇,包括PNAS、Nature Structural and Moleculer Biology、Journal of Neuroscience等高影响因子文章。

 

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