2023年2月7日，《Cell Discovery》期刊在线发表题为《Adenosine-Independent Regulation of the Sleep-Wake Cycle by Astrocyte Activity》的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）徐敏研究员组和上海交通大学医学院张思宇研究员组合作共同完成。该研究采用光纤记录、化学遗传、基因敲除和脑片电生理等技术，结合新型腺苷/ATP荧光探针，发现基底前脑星形胶质细胞钙活动可双向调控睡眠-觉醒行为，且该过程不依赖于胞外腺苷信号。该研究为理解星形胶质细胞在睡眠-觉醒中的作用及机制提供了新的线索。

背景

既往研究表明，星形胶质细胞可通过腺苷途径参与睡眠-觉醒行为调控。这些研究主要通过在星形胶质细胞中表达dnSNARE，从而抑制其胞吐作用，并结合药理学手段拮抗腺苷受体，间接探究了星形胶质细胞来源的腺苷在睡眠-觉醒行为中的调控作用。然而介导dnSNARE在星形胶质细胞中表达的启动子—胶质纤维酸性蛋白（glial-fibrillary acidic protein，GFAP）启动子，存在外源基因在神经元中异位表达情况。因此，星形胶质细胞在睡眠-觉醒调控中的作用和机制尚未明确。此外，最.新研究表明，睡眠觉醒行为关键调控脑区—基底前脑（basal forebrain, BF）中神经元是胞外腺苷的重要来源（Science，2020）。这也说明星形胶质细胞来源的腺苷只是胞外腺苷的一小部分，进一步提示星形胶质细胞极有可能不通过传统上认为的腺苷通路调控睡眠-觉醒周期。

实验结果

为探究基底前脑星形胶质细胞在睡眠-觉醒调控中的作用和机制，研究人员首先建立了可在BF介导星形胶质细胞特异基因表达的方法。通过系统测试，研究人员发现既往研究采用的多种转基因小鼠或病毒策略均导致严重的漏表达，原本设计为靶向星形胶质细胞的基因却表达神经元中（图1），这种漏表达可能与不同脑区星形胶质细胞的多样性相关；而AAV5+GfaABC1D启动子可在基底前脑介导星形胶质细胞高度特异的基因表达（图2）。

图2 | AAV5+GfaABC1D介导星形胶质细胞特异基因表达

研究人员接下来通过光纤记录探究了BF星形胶质细胞在睡眠-觉醒周期中的活动模式，发现BF星形胶质细胞在觉醒期活跃程度大幅升高（图3），提示它们可能参与了觉醒行为的维持。

图3 | BF星形胶质细胞在觉醒期高度活跃

为揭示BF星形胶质细胞对睡眠-觉醒周期的调控作用，研究人员采用化学遗传和条件性敲除IP3R2受体两种方法分别激活和抑制了BF星形胶质细胞的钙活动，并记录分析了小鼠睡眠觉醒行为的变化情况。研究发现，激活BF星形胶质细胞导致小鼠NREM睡眠碎片化，REM睡眠时长减少，表明小鼠睡眠质量下降、觉醒水平增加；而抑制BF星形胶质细胞则显著降低了小鼠的觉醒水平(图4)。以上结果表明，BF星形胶质细胞可双向调控睡眠-觉醒行为。

图4 | BF星形胶质细胞双向调节睡眠-觉醒行为

在确定BF星形胶质细胞对睡眠-觉醒周期的调控作用之后，研究人员进一步探究了腺苷信号是否在该过程中发挥了重要作用。既往研究认为，星形胶质细胞首先分泌ATP、ATP再通过一系列胞外酶降解为腺苷。因此，研究人员首先采用北京大学李毓龙教授团队开发的腺苷和ATP探针，测量了星形胶质细胞钙活动与胞外腺苷和ATP之间的相关性。研究发现，星形胶质细胞钙活动与胞外腺苷和ATP信号高度相关，星形胶质细胞钙活动与ATP信号在时程上具有一致性，并且二者均提前于腺苷信号（图5）。以上结果提示星形胶质细胞可能通过释放ATP驱动了胞外腺苷水平的上升。

图5 | BF星形胶质细胞钙活动与胞外ATP和ADO信号高度相关

研究人员接下来探究了星形胶质细胞钙活动对胞外腺苷浓度上升的贡献。然而，多个层面的实验证据表明，BF脑区星形胶质细胞并非胞外腺苷的重要来源。首先，采用光遗传方法升高星形胶质细胞钙活动并不能引起胞外腺苷浓度的显著升高（图6）；其次，敲除介导胞外ATP向腺苷转化的关键酶CD73也不影响胞外腺苷浓度（图6）。

图6 | 探究BF星形胶质细胞钙活动对胞外腺苷浓度上升的贡献

最后，考虑到光遗传激活星形胶质细胞所引起的钙活动可能与生理条件下钙活动的模式有所不同，并且胞外ATP也可能通过CD73以外的途径被降解成腺苷，研究人员进一步通过敲除IP3R2受体方法直接抑制星形胶质细胞钙活动。既往研究表明，IP3R2受体敲除可显著降低星形胶质细胞soma和process的钙信号。然而实验发现，敲除IP3R2受体只降低胞外ATP浓度，并不影响腺苷浓度（图7）。以上证据综合表明，由星形胶质细胞释放ATP生成的腺苷只是胞外腺苷来源的一小部分，这进一步提示星形胶质细胞极有可能不通过传统上认为的腺苷通路调控睡眠-觉醒周期。

图7 | BF星形胶质细胞钙活动仅影响胞外ATP信号而不影响ADO信号

接下来研究人员探究了BF脑区星形胶质细胞钙活动的来源及其对神经活动的影响。实验发现，星形胶质细胞钙活动主要由BF脑区神经活动引起（图8），而去甲肾.上腺素和乙酰胆碱等神经调质信号的贡献较小，并且化学遗传激活星型胶质细胞可增加持续性抑制（tonic GABA current），影响神经突触传递（图8）。以上结果提示，BF脑区星形胶质细胞可能通过改变持续性抑制参与睡眠-觉醒调控。

图8 | 星形胶质细胞活动与神经活动之间的互作

最后，研究人员初步探究了BF脑区之外的星形胶质细胞在睡眠-觉醒调控中的作用和机制，发现星形胶质细胞对睡眠-觉醒行为的调控具有脑区特异性。

讨论

星形胶质细胞可通过多种机制调控睡眠-觉醒行为，其中腺苷信号被认为发挥了重要作用。然而既往研究采用非特异的GFAP-Cre小鼠，导致我们无法区分实验结果是星形胶质细胞还是神经元活动改变所造成。当前研究采用病毒介导的高度特异表达体系，结合最.新开发的腺苷和ATP荧光探针以及多种转基因小鼠，探究了BF脑区星形胶质细胞在睡眠-觉醒调控中的作用和机制，发现星形胶质细胞并不通过经典认为的腺苷通路参与睡眠-觉醒调控，而可能通过改变持续性抑制调控睡眠-觉醒周期。

该工作是徐敏研究员在基底前脑调控睡眠-觉醒机制方面的第四项工作。这些工作系统地揭示了基底前脑不同种类的神经元和胶质细胞在睡眠-觉醒周期中的作用。

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该研究在中科院脑智卓越中心徐敏研究员和上海交通大学医学院张思宇研究员指导下，由脑智卓越中心博士后彭婉玲博士、刘晓彤博士和上海交通大学医学院马国芬博士共同完成。上海交通大学医学院博士生王紫玥、王丽昭， 脑智中心博士生费翔、研究助理秦梅玲，北京大学李毓龙教授和武照伐博士也做出了重要贡献。该工作获得中科院、科技部、基金委和上海市等项目资助。

通讯作者介绍：

徐敏，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科研究所）神经环路与行为调控研究组高级研究员，2010年于中国科学院神经科学研究所获博士学位，2010－2016年在加州大学伯克利分校和美国霍华德休斯医学研究所从事博士后研究工作，2016年9月起任中国科学院神经科学研究所研究员。徐敏研究员长期从事睡眠-觉醒调控的神经机理研究。

张思宇，上海交通大学医学院基础医学院暨国家儿童医学中心双聘研究员，博士生导师，国家高层次人才计划获得者。她先后师从于中国科学院神经所蒲慕明教授及加州大学伯克利分校霍华德·休斯医学研究所暨美国科学院院士Yang Dan教授，在Science，Nature，Nature Neuroscience等国际顶.级杂志发表多篇论文。实验室拥有全面的神经生物学最前沿的神经电生理、光遗传学、行为学和病毒介导的解剖学示踪技术，致力于开展高级认知相关神经环路的解剖学及功能学研究。

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