一、简介

在神经科学研究中，我们总是试图回答一个问题：当大脑在进行某项特定任务时，究竟是哪些神经元在工作？为了标记这些活跃的神经元，科学家们开发了多种活动依赖性标记系统。传统的标记系统（如TRAP2、RAM）主要依赖即刻早期基因（IEG，如cFos）相关转录通路，它们的标记窗口通常为6-48小时。这意味着，如果你想研究小鼠在5分钟特定行为中涉及的特异性环路，传统工具会把这5分钟前后几小时内的无关活动全部“打包”标记，信号噪声极大。而scFLARE2（单链快速光控和活动调控表达系统2）的出现，将标记精度从“小时级”直接拉升到了“分钟级”（3-10 min），能够在体、稳定不可逆、特异性标记任意脑区中响应特定行为/刺激的活跃神经元，并可与多种工具（如光遗传学技术）联用，为多种神经科学问题的解析提供强大工具。

二、scFLARE2技术原理

scFLARE2是一个膜锚定单链融合蛋白，结构组成如下：

跨膜结构域（TM）：锚定蛋白于神经元细胞膜；

烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶（CaTEV）：高Ca²⁺浓度诱导构象改变，使CaTEV激活并具备切割能力；

光-氧-电压结构域（LOV）：蓝光诱导构象改变，暴露CaTEV酶切位点（TEVcs）；

TEVcs+转录因子（TF）：酶切后释放TF（tTA-VP16）入核。

两步工作机制：

1.静息状态：CaTEV无活性、LOV遮蔽TEVcs，转录因子被锚定在膜上，无下游基因表达。

2.激活状态：神经元兴奋→胞内Ca²⁺浓度升高激活CaTEV+蓝光照射→LOV构象改变暴露TEVcs→蛋白酶切割释放转录因子→tTA-VP16入核结合四环素诱导型反应元件（TRE）启动子，驱动报告基因（荧光蛋白或其他功能性基因）表达。

图1. scFLARE2工作原理图（Jung, Jung Hoon, et al., Cell reports., 2023.）

三、scFLARE2特点及优势

1.双触发严格特异性：仅在神经元兴奋（胞内高Ca²⁺水平）与蓝光照射同步发生时，系统才被激活并完成永久不可逆标记。

2.超高时间分辨率：仅需3分钟蓝光照射即可完成标记，远优于IEG系统的6-48小时标记窗口。

3.活性耦合精准性：直接耦合神经元Ca²⁺动力学（动作电位的关键指标），而非IEG系统的转录后延迟响应，标记结果更贴合真实神经活动。

4.功能一体化：可同步实现活性标记+功能调控（如光遗传学操控）。

5.靶向特异性强：精准标记特定行为/刺激诱导的活跃神经元，排除非特异性标记。

6.背景信号极低

四、scFLARE2应用流程

实验流程通常包含以下几个步骤：

1.病毒注射：向目标脑区共注射AAV-scFLARE2与AAV-TRE-目的基因病毒。

2.光纤植入：于注射位点上方植入光纤。

3.行为训练与标记：病毒充分表达（约4周）后，在目标行为训练期间，通过光纤给予特定波长蓝光刺激，精准标记该行为下的活跃神经元。

4.功能操控与检测：根据研究目的，可对标记的神经元进行光遗传学等操控；或在特定时间点取材，开展组织学与免疫荧光分析。

五、应用案例

1、解析时间依赖的记忆关联与分离机制

研究人员在小鼠外侧杏仁核（LA）共注射AAV-scFLARE2与AAV-TRE-eNpHR3.0-mCherry，病毒表达4周后开展两次听觉威胁条件反射训练：训练1为2.8 kHz纯音（CS1）配对电击，训练2为7.5 kHz脉冲音（CS2）配对电击，两次训练间隔设为3小时（时间邻近）或27小时（时间较远）。训练1期间用蓝光标记活跃神经元并使其表达红光（RL）敏感的抑制性光蛋白eNpHR3.0，后续在红光关闭/开启条件下，检测小鼠对CS1、CS2的记忆提取。结果显示，沉默训练1标记的神经元会破坏CS1的记忆提取（冻结水平下降）；但对于CS2的记忆，仅3小时间隔组的冻结水平被显著抑制，27小时间隔组无明显变化。该结果证实，时间邻近的经历通过“共分配”共享重叠痕迹集群实现记忆关联；时间较远的经历通过“分离分配”占用正交痕迹集群实现记忆离散。该应用充分展现了scFLARE2突破传统标记工具时间分辨率局限的核心优势。

图2. 利用scFLARE2探究小鼠的记忆关联与分离（Jung, Jung Hoon, et al., Cell reports., 2023.）

2、探究记忆泛化的神经基础

为揭示记忆泛化的神经机制，研究人员在小鼠LA共注射AAV-scFLARE2与AAV-TRE-eNpHR3.0-mCherry，采用3小时/27小时间隔的双次听觉威胁条件反射训练，并引入介于CS1与CS2间的全新音调CS3（5.6 kHz）检测记忆泛化。结果显示，3小时间隔组对CS3的冻结行为水平显著更高；光遗传学沉默训练2标记的神经元后，仅3小时组的CS3与CS1冻结水平同步降低，且二者冻结水平呈正相关，27小时组无此效应。该结果证实，共分配形成的重叠记忆痕迹集群不仅关联了CS1和CS2的记忆，还构建了泛化记忆表征，使得小鼠能将威胁记忆延伸至具有共性的全新刺激，证实共分配是记忆泛化的重要神经基础。

图3. 利用scFLARE2探究记忆泛化的神经基础（Jung, Jung Hoon, et al., Cell reports., 2023.）

枢密科技可提供scFLARE2病毒产品，部分列表如下：